DE69920599T2 - Verfahren zur Verhinderung von Hämoglobininterferenzen in Reagenzsystemen die für peroxidase Bestimmung geeignet sind - Google Patents

Verfahren zur Verhinderung von Hämoglobininterferenzen in Reagenzsystemen die für peroxidase Bestimmung geeignet sind Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung von Verfahren zum Nachweis der Peroxidase-Aktivität in Proben von Körperflüssigkeiten dar, deren Empfindlichkeit durch Hämoglobin-Interferenz beeinträchtigt wird. Beispielsweise ist in US 5,379,561 ein Verfahren zum Nachweis von Kreatinin in Urin offenbart, wobei man eine Urinprobe, von der vermutet wird, dass sie Kreatinin enthält, in Kontakt mit Kupferionen, einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Farbstoff bringt, welcher eine gefärbte Reaktion in der Gegenwart von Sauerstoff-freien Radikalen und eines Hydroperoxids ergibt. In diesem Assay beinhaltet die erste Stufe die Bildung eines Cu++-Kreatinin-Chelat-Komplexes. Der oxidierbare Farbstoff wird durch Transfer eines Elektrons daraus auf den Cu++-Kreatinin-Komplex oxidiert, um die nichtreaktive Cu+-Kreatinin-Form zu ergeben, die zu Cu++-Kreatinin durch den Verlust eines Elektrons an das Hydroperoxid regeneriert wird. Dieser Assay funktioniert gut in der Abwesenheit von Hämoglobin, in der Anwesenheit von Hämoglobin wird aber seine Genauigkeit wegen der Tendenz des Hämoglobins zur Oxidation des Farbstoffs beeinflusst, wodurch falsche Positivergebnisse verursacht werden. Da Hämaglobin häufig in Körperflüssigkeiten wie Urin vorgefunden wird, müsste dessen Interferenz blockiert werden, um dadurch einen genaueren Assay zu ergeben.
  • In EP 0 929 521 ist ein Assay für einen Analyt in einer fluiden Testprobe offenbart, wobei die fluide Testprobe mit einem Reagenssystem zusammengebracht wird, das eine Apo-Peroxidase, einen Redox-Farbstoff, ein Hydroperoxid und ein Übergangsmetall-Porphyrin-Chelat umfasst, das an einen Analyt/Analyt-spezifischen Bindungspartner mit einem kombinierten Molekulargewicht von mindestens ca. 180 K Daltons gebunden wird. Tritt dieses Konjugat in Wechselwirkung mit Analyt in der fluiden Testprobe, wird ein Teil des spezifischen Bindungspartners aus dem Konjugat dissoziiert, wodurch das Metall-Porphyrin befähigt wird, die Apo-Peroxidase zu rekonstituieren, wobei dann die rekonstituierte Peroxidase mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff in Wechselwirkung treten kann, um eine Farbreaktion mit dem Analyt in der fluiden Testprobe zu ergeben. Dieser Assay-Typ wird ebenfalls durch die Anwesenheit von Hämoglobin in der fluiden Testprobe wegen der Oxidation des Redox-Farbstoffs in der Gegenwart eines Hydroperoxids gegenläufig beeinflusst.
  • Weitere Assays unter Anwendung von Metall-Chelaten schließen Eisenion/Kreatinin, Übergangsmetall/2,2'-Dipyridyl, Übergangsmetall/Diethylenpolyaminopolyessigsäuren wie EGTA, HEDTA und NTA, Übergangsmetall/Oxime, Übergangsmetall/Phenanthroline, Übergangsmetall/Thiocarbamide, Übergangsmetall/Triethylentetramin und Übergangsmetall/Catechin ein. Die Anwendung von Eisen-Chelaten und insbesondere von Eisen-Kreatin zum Nachweis von Wasserstoffperoxid ist in US 5,702,955 offenbart.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verbesserung eines Assays bezüglich der Aktivität eines Metall-Chelats, dessen Aktivität auf die Konzentration eines Analyt in einer fluiden Testprobe bezogen ist. Der Assay beinhaltet, dass man die fluide Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den Analyt enthält, mit einem Metall-Chelat oder mit Vorstufen davon, einem Hydroperoxid und mit einem Redox-Indikator zusammenbringt, welcher in der Gegenwart des Metall-Chelats und Hydroperoxids oxidierbar ist, um eine Farbreaktion zu ergeben, die die Gegenwart des Metallchelats anzeigt. Die Verbesserung beinhaltet, dass man die Assaykomponenten mit einem Pyrazol-Derivat zusammenbringt, der die Fähigkeit von Hämoglobin zur Oxidation des Redox-Farbstoffes inhibiert, ohne die Fähigkeit des Metall-Chelats zur Verursachung einer solchen Oxidation wesentlich zu inhibieren.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Ein neues Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Kreatinin-Konzentration in fluiden Testproben ist in US 5,379,561 offenbart. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil der Peroxidase-Aktivität von Kreatinin/Übergangsmetall-Komplexen. In diesem Assay erzeugt die Chelatbildung von Übergangsmetallen durch Kreatinin einen Komplex, der dazu befähig ist, die Oxidation eines oxidierbaren Farbstoffs wie von Tetramethylbenzidin durch ein Hydroperoxid wie Diisopropylbenzoldihydroperoxid zu katalysieren, um dadurch eine gefärbte Reaktion zu ergeben. Vor kürzerer Zeit ist herausgefunden worden, dass dieser Assay etwas ungenau durch die Reaktion von Hämoglobin ausfällt, das gewöhnlich in Körperflüssigkeiten vorgefunden wird. Dieses Problem wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, durch welche eine Gruppe von Pyrazol-Derivaten herausgefunden worden ist, die eine Hämoglobin-Interferenz in diesem Assay verhindern. J. Ziegenhorn et al. berichten, dass ein Pyrazol-Derivat, ein Aminopyrin, ein Redox-Indikator der Peroxidase-Aktivität, insbesondere in der Gegenwart von Phenol und Peroxid, ist, siehe J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15:1977:13–9. Während diese Bezugsliteratur offenbart, dass Hämoglobin durch Peroxid und ein Pyrazol-Derivat mit Phenol nachgewiesen werden kann, handelt sie nicht von der Anwendung von Pyrazol-Derivaten zur Verhinderung einer Hämoglobin-Interferenz in der Gegenwart von Peroxid.
  • In US 4,385,119 ist die Fähigkeit von Hydroperoxid und eines Redox-Indikators zum Nachweis der Peroxidase-Aktivität von Hämoglobin offenbart. Es ist diese Reaktivität von Hämoglobin mit dem Hydroperoxid, womit die vorliegende Erfindung dazu entworfen ist, diese zu inhibieren, um dadurch falsche Positivergebnisse im Assay zu vermeiden.
  • Verschiedene Lösungsansätze wurden zur Verhinderung einer Hämoglobin-Interferenz durch die Zugabe von Hämoglobin-Fängern zum Testfluid entweder durch direkte Zugabe zum Specimen oder durch Zugabe zum Reagens unter anschließender Vermischung des Reagens mit dem Specimen untersucht. Die Konzentration betrug 0,5 bis 10 mM. Die bewerteten Vorgehensweisen sind in Tabelle 1 zusammengefasst:
  • Tabelle 1 Verbindungen, die zum Abfangen von Hämoglobin bewertet wurden
    Figure 00030001
  • Unter diesen Verfahrensweisen einer anionischen Bindung an Eisenatome am Hämoglobin mit farblosen, konkurrierenden Substraten für die Peroxidase, mit Eisen-Chelatoren, die nicht an Kupfer gebunden werden, und mit einer Zerstörung des Hämoglobins herunter zu Hämatin durch starke Oxidanzien er wiesen sich nur die Anwendung konkurrierender Substrate und darunter nur relativ wenige Pyrazole als wirkungsvoll zur Erstellung einer Hämoglobin-Beständigkeit, ohne mit dem Kreatinin-Assay zu interferieren. Unter diesen Pyrazolen, die getestet wurden, wurden die folgenden Verbindungen herausgefunden, um die gewünschten Ergebnisse zu liefern:
    3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on,
    9-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure,
    Phenbutazon und
    Oxyphenbutazon.
  • Bezogen auf die Strukturen dieser Verbindungen, kann ermittelt werden, dass diese Pyrazole, die wirkungsvoll sind, um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu ergeben, eine Phenyl-Gruppe aufweisen müssen, die an ein Stickstoffatom im Pyrazol-Ring gebunden ist, wobei dieser Stickstoff direkt an eine Carbonyl-Gruppe gebunden ist. Bezogen auf die durchgeführten Versuche, sollten die wirkungsvollen Pyrazole keine exocyclischen Amine, d.h. Amin-Gruppen, aufweisen, die nicht Teil des Rings sind, aber an Atome gebunden sind, die den Ring bilden oder damit verbunden sind.
  • Demnach eignen sich Pyrazole gemäß der Formel:
    Figure 00040001
    worin X = CO2H, H oder OH, Y = CH, CH2, C=O, CCH3 oder CH(CH2CH2CH3) und Z=H, C6H5 oder keines, zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung.
  • Im Kupfer+2-Assay kann die Quelle der Kupferionen jedes lösliche Kupfersalz sein, dessen Anion nicht nicht nachteilig mit der Reaktion zum kolorimetrischen Nachweis von Kreatinin in Wechselwirkung tritt. Geeignete Salze schließen Kupfersulfat, -nitratoxid, -hydroxid, -phosphat, -jodid, -chlorid, -bromid, -acetat oder -oxalat ein. Weitere lösliche Kupfersalze können verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die Bildung des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes ermöglichen. Diejenigen Salze, deren Anion zu stark an das Kupfer gebunden wird, ermöglichen die Bildung des Kupfer(II)-Kreatinin-Komplexes nicht. Demzufolge würden Cu(II)-Komplexe, wie diejenigen, die zwischen Kupferionen und EDTA, HEDTA, EGTA und DTPA gebildet werden, nicht genügend Cu(II) zur Bildung des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes freisetzen. Es ist beobachtet worden, dass die Zitrat- und Sulfat-Salze die niedrigste Leer-Reaktivität aufweisen und demzufolge bevorzugt sind. Kupferzitrat ist besonders bevorzugt, weil es die geringste Leer-Reaktivität und die größte Bildung des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes zeigt und ergibt. Salze, die den Farbstoff in der Abwesenheit von Kreatinin oxidieren, sind weniger erwünscht. Salze wie Kupfer-2,2'-bipyridin können eine signifikante Oxidation von TMB in der Abwesenheit von Kreatinin verursachen und sind daher ungeeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Bei Verwendung von Kupferzitrat als die Kupferion-Quelle sollte die Konzentration des Zitrat-Ions zumindest diejenige des Kupfers ausmachen. Ein mindestens zweifacher Überschuss des Zitrat-Ions zum Kupfer-Ion ist bevorzugt, um eine vollständige Komplexierung von Cu(II) durch das Zitrat sicherzustellen.
  • Ist Urin das wässrige Fluid, das getestet wird, beträgt die Konzentration des Kupfer-Ions in typischer Weise 5 bis 30 mM, da der Bezugsbereich von Kreatinin in Urin 3 bis 20 mM beträgt. Dieser Bereich würde in weiteren Fluiden wie Serum variieren, wo man vorzugsweise eine Konzentration des Kupfer-Ions im Bereich von 0,05 bis 0,30 mM anwenden würde. Das Kupfer-Ion neigt dazu, etwas Hintergrund-Interferenz wegen Oxidation des Farbstoffs in der Abwesenheit von Kreatinin zu verursachen. Demzufolge können Cu(I)-Salze nicht verwendet werden.
  • Geeignete oxidierbare Indikatoren schließen z.B. Benzidin, o-Toluidin, ein 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin, worin die Alkyl-Gruppe 1 bis ca. 6 Kohlenstoffatome einschließt, o-Dianisidin, 2,7-Diaminofluoren, Bis(N-ethylchinol-2-on)azin, (N-Methylbenzthiazol-2-on)-(1-ethyl-3-phenyl-5-methyltriazol-2-on)azin oder Kombinationen davon ein.
  • Geeignete Hydroperoxide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Cumolhydroperoxid, 5-Butylhydroperoxid, Diisopropylbenzohydroperoxid, 1-Hydroxycyclohexan-1-hydroperoxid, 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, p-Menthanhydroperoxid, 1,9-Diisopropylbenzolmonohydroperoxid, p-t-Butylisopropylbenzolhydroperoxid, 2-(α-Hydroperoxyisopropyl)-6-isopropylnaphthalin, Tetralinhydroperoxid oder Kombinationen davon ein.
  • In typischer Weise wird das Reagenssystem, das das lösliche Kupfersalz, Hydroperoxid und einen oxidierbaren Indikator umfasst, in Wasser gelöst. Allerdings können organische Lösungsmittel unter der Voraussetzung in das System eingebracht werden, dass sie den Assay-Mechanismus nicht stören. Die Konzentration des Hydroperoxids und des oxidierbaren Indikators liegen im Normalfall im Bereich von 10 bis 150 mM, wobei ein Bereich von 60 bis 100 mM bevorzugt ist.
  • Zur Durchführung der Erfindung kann der Assay entweder im Nass- oder im Trocken-(Teststreifen)-Format durchgeführt werden. Zur Ausführung des Assays wird die Testprobe mit dem Kupfersalz, z.B. mit Kupferzitrat, dem Farbstoff und dem Hydroperoxid bei einem gepufferten pH-Wert, vorzugsweise von 9,0 bis 9,0, durch die Anwendung eines Reagensstreifens oder von wässrigen und Acetonitril-Lösungen der Reagenzien vermischt. Reagensstreifen werden in herkömmlicher Weise hergestellt, wobei ein absorbierender Träger in eine wässrige Lösung des Kupfersalzes und von Puffern getaucht, der Träger getrocknet und dann in eine organische Lösung des Farbstoffs und des Hydroperoxids getaucht wird, worauf das Ganze getrocknet wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch weiter erläutert:
  • Beispiel I
  • Ein Teststreifen zum Nachweis von Kreatinin wurde durch ein zweistufiges Tauch-Verfahren hergestellt, wobei ein Streifen aus Whatman 3 mm Filterpapier in eine erste Tauch-Lösung getaucht, bei 100°C 6 bis 8 min lang getrocknet und dann in eine zweite Tauch-Lösung unter anschließender Trocknung getaucht wurde. Die ersten und zweiten Tauch-Lösungen wurden wie folgt zubereitet: 1. Tauch-Lösung
    Komponente Konzentration
    CuSO4 30 mM
    Zitrat 50 mM
    Glyceryl-2-phosphat als Puffer 750 mM
    Aerosol IB-95 als oberflächenaktives Mittel (Pflatz & Bayer) 1,5% (G/V)
    pH 6,80
    Wasser
    2. Tauch-Lösung
    Komponente Konzentration
    3,3';5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) 33 mM
    Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH) 80 mM
    Polymer: Plasdone als Separator/Stabilisierer 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on 3 mM
    Ethyl-Orange 0,032 % (G/V)
    95%iger Alkohol
  • Dieser Streifen wurde bezüglich seiner Fähigkeit zur Steigerung der Hämoglobin-Resistenz der Formulierung durch visuelle und instrumentelle Analyse getestet. Ein 50 mg/dL-Kreatinin-Urin-Standard wurde mit 1 mg/dL Hämoglobin versetzt. Der 50 mg/dL-Standard mit Hämoglobin wurde instrumentell unter Anwendung eines CLINITEK 50- und CLINITEK 100-Reflexionsspektrometers und visuell unter Anwendung einer Kreatinin-Farbkarte gegen Urin-Standards, enthaltend 50, 100, 200 und 300 mg/dL Kreatinin, verglichen. Bei Raumtemperatur aufbewahrte und belastete (1 Woche bei 60°C) Streifen wurden bewertet. Mit dem Streifen wurde gefunden, dass er ein 50 mg/dL-Ergebnis für eine Urinprobe ergab, die 50 mg/dL Kreatinin und 10 mg/dL Hämoglobin enthielt. Dies steht in Kontrast zum gleichen Kreatinin-Reagens, bei dem das Pyrazol fehlt, welches ein Ergebnis von 300 mg/dL mit einem Urin erzeugte, der 50 mg/dL Kreatinin und 1 mg/dL Hämoglobin enthielt. Das Ziel dieses Versuches war ein zweifaches. Erstens sollte ein Assay erzielt werden, bei welchem die Ergebnisse, die mit einer Probe mit 50 mg/dL Kreatinin und 1 mg/dL Hämoglobin erhalten werden, die gleichen wie die für 50 mg/dL Kreatinin und kein Hämoglobin wären, und zweitens sollte eine Reaktivitätssteigerung um nicht mehr als 1 Niveau für bis zu 10 mg/dL Hämoglobin (d.h. ≤100 mg/dL Kreatinin) am Niveau von 50 mg/dL Kreatinin bewerkstelligt werden.
  • Beispiel II
  • Weitere Pyrazol-Verbindungen wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Erstellung einer Resistenz gegen die Tendenz des Hämoglobins zur Oxidation des TMB-Indikators in gleicher Weise wie der in Beispiel I beschriebenen untersucht. Die Pyrazol-Konzentration in der zweiten Tauch-Lösung, die zur Herstellung des Streifens eingesetzt wurde, betrug in typischer Weise 0,5 bis 5 mM. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2 angegeben: Tabelle 2 In der Kreatinin-Formulierung untersuchte Pyrazol-Derivate
    Figure 00070001
    Figure 00080001
  • Aus den Daten der Tabelle 2 ist ermittelbar, dass sowohl Phenbutazon als auch Oxyphenbutazon belegen, dass zwei aromatische Gruppe an 2 Ring-Stickstoffe gebunden sein können, die zu Carbonyl-Gruppen benachbart sind. Die Ergebnisse mit 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on und mit 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure zeigen für beide, dass nur 1 Carbonyl- und 1 aromatische Gruppe an einen Ring-Stickstoff gebunden zu sein brauchen, um die gewünschte Hämoglobin-Resistenz zu bewirken.
  • Die Ergebnisse mit Antipyren und Phenidon belegen, dass eine aromatische Gruppe an den am nächsten zum Carbonyl gelegenen Stickstoff gebunden sein muss, um das gewünschte Ergebnis zu liefern, wogegen die Aktivität von 5-Amino-1-phenyl-4-pyrazolcarboxamid und von 3-Methyl-1-phenylpyrazol zeigen, dass das zum Stickstoff benachbarte Carboxyl notwendig ist, wogegen das Misslingen mit 3-Amino-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on zeigt, dass ein Amin-Substituent zur Herabsetzung der Hämoglobin-Interferenz schädlich ist. Schließlich belegen die Ergebnisse mit 1-(9-Nitrophenyl)-3-pyrolidino-2-pyrazolin-5-on, dass die Nitro-Substitution oder das Vorliegen einer Elektron-abziehenden Gruppe am aromatischen Ring das Pyrazol ineffektiv zur Herabsetzung der Hämoglobin-Interferenz machen.

Claims (10)

  1. Assay für die Aktivität eines Komplexes aus Kreatinin und Kupfer-Ionen in einer fluiden Testprobe, wobei der Assay beinhaltet, dass ein Komplex aus Kreatinin und Kupfer-Ionen mit einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Indikator zusammengebracht wird, der in der Gegenwart des Komplexes aus Kreatinin und Kupfer-Ionen und von Hydroperoxid oxidierbar ist, um eine Farbreaktion zu ergeben, die das Vorliegen des Komplexes aus Kreatinin und Kupfer-Ionen anzeigt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den im Assay vorgesehenen Einschluss eines Pyrazol-Derivats umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, Phenbutazon und aus Oxyphenbutazon.
  2. Assay gemäß Anspruch 1, worin die Reagenzien in trockener Form auf einem absorbierenden Träger vorliegen.
  3. Assay gemäß Anspruch 1, worin die fluide Testprobe Urin ist.
  4. Assay gemäß Anspruch 1, worin die Konzentration des Pyrazols 0,5 bis 5 mM beträgt.
  5. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Pyrazol-Derivat 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on ist.
  6. Assay für Kreatinin in Urin, dadurch gekennzeichnet, dass der Urin mit Kupfer-Ionen, einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Farbstoff zusammengebracht wird, welcher eine Farbreaktion in der Gegenwart des Hydroperoxids zusammen mit einem Pyrazol-Derivat ergibt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, Phenbutazon und aus Oxyphenbutazon.
  7. Assay gemäß Anspruch 6, worin die Konzentration des Pyrazol-Derivats 0,5 bis 5 mM beträgt.
  8. Assay gemäß Anspruch 6, worin das Pyrazol-Derivat 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on ist.
  9. Verfahren zur Bestimmung von Kreatinin in einer Urinprobe, wobei die Urinprobe mit CuSO4, Hydroperoxid, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und mit 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on zusammengebracht wird, um eine Farbänderung zu erhalten, und wobei die Größe der Farbänderung zur Bestimmung der Kreatinin-Konzentration in der Urinprobe gemessen wird.
  10. Test-Kit für Kreatinin, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: a) Kupfer-Ionen, b) ein Hydroperoxid, c) einen oxidierbaren Farbstoff, der eine Farbreaktion in der Gegenwart des Hydroperoxids ergibt, und d) ein Pyrazol-Derivat, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 3-Methyl-1phenyl-2-pyrazolin-5-on, 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure, Phenbutazon und aus Oxyphenbutazon.
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