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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung von Verfahren zum
Nachweis der Peroxidase-Aktivität
in Proben von Körperflüssigkeiten
dar, deren Empfindlichkeit durch Hämoglobin-Interferenz beeinträchtigt wird.
Beispielsweise ist in
US 5,379,561 ein
Verfahren zum Nachweis von Kreatinin in Urin offenbart, wobei man
eine Urinprobe, von der vermutet wird, dass sie Kreatinin enthält, in Kontakt
mit Kupferionen, einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Farbstoff
bringt, welcher eine gefärbte
Reaktion in der Gegenwart von Sauerstoff-freien Radikalen und eines
Hydroperoxids ergibt. In diesem Assay beinhaltet die erste Stufe
die Bildung eines Cu
++-Kreatinin-Chelat-Komplexes. Der oxidierbare
Farbstoff wird durch Transfer eines Elektrons daraus auf den Cu
++-Kreatinin-Komplex oxidiert, um die nichtreaktive
Cu
+-Kreatinin-Form zu ergeben, die zu Cu
++-Kreatinin durch den Verlust eines Elektrons
an das Hydroperoxid regeneriert wird. Dieser Assay funktioniert
gut in der Abwesenheit von Hämoglobin,
in der Anwesenheit von Hämoglobin
wird aber seine Genauigkeit wegen der Tendenz des Hämoglobins
zur Oxidation des Farbstoffs beeinflusst, wodurch falsche Positivergebnisse verursacht
werden. Da Hämaglobin
häufig
in Körperflüssigkeiten
wie Urin vorgefunden wird, müsste
dessen Interferenz blockiert werden, um dadurch einen genaueren
Assay zu ergeben.
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In
EP 0 929 521 ist ein Assay
für einen
Analyt in einer fluiden Testprobe offenbart, wobei die fluide Testprobe
mit einem Reagenssystem zusammengebracht wird, das eine Apo-Peroxidase,
einen Redox-Farbstoff, ein Hydroperoxid und ein Übergangsmetall-Porphyrin-Chelat
umfasst, das an einen Analyt/Analyt-spezifischen Bindungspartner
mit einem kombinierten Molekulargewicht von mindestens ca. 180 K
Daltons gebunden wird. Tritt dieses Konjugat in Wechselwirkung mit
Analyt in der fluiden Testprobe, wird ein Teil des spezifischen
Bindungspartners aus dem Konjugat dissoziiert, wodurch das Metall-Porphyrin
befähigt
wird, die Apo-Peroxidase zu rekonstituieren, wobei dann die rekonstituierte
Peroxidase mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff in Wechselwirkung
treten kann, um eine Farbreaktion mit dem Analyt in der fluiden
Testprobe zu ergeben. Dieser Assay-Typ wird ebenfalls durch die
Anwesenheit von Hämoglobin
in der fluiden Testprobe wegen der Oxidation des Redox-Farbstoffs
in der Gegenwart eines Hydroperoxids gegenläufig beeinflusst.
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Weitere
Assays unter Anwendung von Metall-Chelaten schließen Eisenion/Kreatinin, Übergangsmetall/2,2'-Dipyridyl, Übergangsmetall/Diethylenpolyaminopolyessigsäuren wie
EGTA, HEDTA und NTA, Übergangsmetall/Oxime, Übergangsmetall/Phenanthroline, Übergangsmetall/Thiocarbamide, Übergangsmetall/Triethylentetramin
und Übergangsmetall/Catechin
ein. Die Anwendung von Eisen-Chelaten und insbesondere von Eisen-Kreatin
zum Nachweis von Wasserstoffperoxid ist in
US 5,702,955 offenbart.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet die Verbesserung eines Assays bezüglich der
Aktivität
eines Metall-Chelats, dessen Aktivität auf die Konzentration eines
Analyt in einer fluiden Testprobe bezogen ist. Der Assay beinhaltet,
dass man die fluide Testprobe, von der vermutet wird, dass sie den
Analyt enthält,
mit einem Metall-Chelat oder mit Vorstufen davon, einem Hydroperoxid
und mit einem Redox-Indikator zusammenbringt, welcher in der Gegenwart
des Metall-Chelats und Hydroperoxids oxidierbar ist, um eine Farbreaktion
zu ergeben, die die Gegenwart des Metallchelats anzeigt. Die Verbesserung
beinhaltet, dass man die Assaykomponenten mit einem Pyrazol-Derivat zusammenbringt,
der die Fähigkeit
von Hämoglobin
zur Oxidation des Redox-Farbstoffes inhibiert, ohne die Fähigkeit
des Metall-Chelats zur Verursachung einer solchen Oxidation wesentlich
zu inhibieren.
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Beschreibung
der Erfindung
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Ein
neues Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Kreatinin-Konzentration in
fluiden Testproben ist in
US
5,379,561 offenbart. Dieses Verfahren nutzt den Vorteil
der Peroxidase-Aktivität
von Kreatinin/Übergangsmetall-Komplexen.
In diesem Assay erzeugt die Chelatbildung von Übergangsmetallen durch Kreatinin
einen Komplex, der dazu befähig
ist, die Oxidation eines oxidierbaren Farbstoffs wie von Tetramethylbenzidin
durch ein Hydroperoxid wie Diisopropylbenzoldihydroperoxid zu katalysieren,
um dadurch eine gefärbte
Reaktion zu ergeben. Vor kürzerer
Zeit ist herausgefunden worden, dass dieser Assay etwas ungenau
durch die Reaktion von Hämoglobin
ausfällt,
das gewöhnlich
in Körperflüssigkeiten
vorgefunden wird. Dieses Problem wird durch die vorliegende Erfindung
gelöst,
durch welche eine Gruppe von Pyrazol-Derivaten herausgefunden worden
ist, die eine Hämoglobin-Interferenz
in diesem Assay verhindern. J. Ziegenhorn et al. berichten, dass
ein Pyrazol-Derivat, ein Aminopyrin, ein Redox-Indikator der Peroxidase-Aktivität, insbesondere
in der Gegenwart von Phenol und Peroxid, ist, siehe J. Clin. Chem.
Clin. Biochem. 15:1977:13–9.
Während diese
Bezugsliteratur offenbart, dass Hämoglobin durch Peroxid und
ein Pyrazol-Derivat mit Phenol nachgewiesen werden kann, handelt
sie nicht von der Anwendung von Pyrazol-Derivaten zur Verhinderung
einer Hämoglobin-Interferenz
in der Gegenwart von Peroxid.
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In
US 4,385,119 ist die Fähigkeit
von Hydroperoxid und eines Redox-Indikators
zum Nachweis der Peroxidase-Aktivität von Hämoglobin offenbart. Es ist
diese Reaktivität
von Hämoglobin
mit dem Hydroperoxid, womit die vorliegende Erfindung dazu entworfen
ist, diese zu inhibieren, um dadurch falsche Positivergebnisse im
Assay zu vermeiden.
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Verschiedene
Lösungsansätze wurden
zur Verhinderung einer Hämoglobin-Interferenz durch
die Zugabe von Hämoglobin-Fängern zum
Testfluid entweder durch direkte Zugabe zum Specimen oder durch
Zugabe zum Reagens unter anschließender Vermischung des Reagens
mit dem Specimen untersucht. Die Konzentration betrug 0,5 bis 10
mM. Die bewerteten Vorgehensweisen sind in Tabelle 1 zusammengefasst:
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Tabelle
1 Verbindungen,
die zum Abfangen von Hämoglobin
bewertet wurden
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Unter
diesen Verfahrensweisen einer anionischen Bindung an Eisenatome
am Hämoglobin
mit farblosen, konkurrierenden Substraten für die Peroxidase, mit Eisen-Chelatoren,
die nicht an Kupfer gebunden werden, und mit einer Zerstörung des
Hämoglobins
herunter zu Hämatin
durch starke Oxidanzien er wiesen sich nur die Anwendung konkurrierender
Substrate und darunter nur relativ wenige Pyrazole als wirkungsvoll
zur Erstellung einer Hämoglobin-Beständigkeit,
ohne mit dem Kreatinin-Assay zu interferieren. Unter diesen Pyrazolen,
die getestet wurden, wurden die folgenden Verbindungen herausgefunden,
um die gewünschten
Ergebnisse zu liefern:
3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on,
9-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure,
Phenbutazon
und
Oxyphenbutazon.
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Bezogen
auf die Strukturen dieser Verbindungen, kann ermittelt werden, dass
diese Pyrazole, die wirkungsvoll sind, um die Vorteile der vorliegenden
Erfindung zu ergeben, eine Phenyl-Gruppe aufweisen müssen, die
an ein Stickstoffatom im Pyrazol-Ring gebunden ist, wobei dieser
Stickstoff direkt an eine Carbonyl-Gruppe gebunden ist. Bezogen
auf die durchgeführten
Versuche, sollten die wirkungsvollen Pyrazole keine exocyclischen
Amine, d.h. Amin-Gruppen, aufweisen, die nicht Teil des Rings sind,
aber an Atome gebunden sind, die den Ring bilden oder damit verbunden
sind.
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Demnach
eignen sich Pyrazole gemäß der Formel:
worin X = CO
2H,
H oder OH, Y = CH, CH
2, C=O, CCH
3 oder CH(CH
2CH
2CH
3) und Z=H, C
6H
5 oder keines,
zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung.
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Im
Kupfer+2-Assay kann die Quelle der Kupferionen
jedes lösliche
Kupfersalz sein, dessen Anion nicht nicht nachteilig mit der Reaktion
zum kolorimetrischen Nachweis von Kreatinin in Wechselwirkung tritt.
Geeignete Salze schließen
Kupfersulfat, -nitratoxid, -hydroxid, -phosphat, -jodid, -chlorid,
-bromid, -acetat oder -oxalat ein. Weitere lösliche Kupfersalze können verwendet
werden, vorausgesetzt, dass sie die Bildung des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes
ermöglichen.
Diejenigen Salze, deren Anion zu stark an das Kupfer gebunden wird,
ermöglichen
die Bildung des Kupfer(II)-Kreatinin-Komplexes nicht. Demzufolge würden Cu(II)-Komplexe, wie
diejenigen, die zwischen Kupferionen und EDTA, HEDTA, EGTA und DTPA
gebildet werden, nicht genügend
Cu(II) zur Bildung des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes freisetzen. Es
ist beobachtet worden, dass die Zitrat- und Sulfat-Salze die niedrigste
Leer-Reaktivität
aufweisen und demzufolge bevorzugt sind. Kupferzitrat ist besonders
bevorzugt, weil es die geringste Leer-Reaktivität und die größte Bildung
des Cu(II)-Kreatinin-Komplexes zeigt und ergibt. Salze, die den
Farbstoff in der Abwesenheit von Kreatinin oxidieren, sind weniger
erwünscht.
Salze wie Kupfer-2,2'-bipyridin
können
eine signifikante Oxidation von TMB in der Abwesenheit von Kreatinin
verursachen und sind daher ungeeignet zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung. Bei Verwendung von Kupferzitrat als die Kupferion-Quelle
sollte die Konzentration des Zitrat-Ions zumindest diejenige des Kupfers
ausmachen. Ein mindestens zweifacher Überschuss des Zitrat-Ions zum
Kupfer-Ion ist bevorzugt, um eine vollständige Komplexierung von Cu(II)
durch das Zitrat sicherzustellen.
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Ist
Urin das wässrige
Fluid, das getestet wird, beträgt
die Konzentration des Kupfer-Ions in typischer Weise 5 bis 30 mM,
da der Bezugsbereich von Kreatinin in Urin 3 bis 20 mM beträgt. Dieser
Bereich würde
in weiteren Fluiden wie Serum variieren, wo man vorzugsweise eine
Konzentration des Kupfer-Ions im Bereich von 0,05 bis 0,30 mM anwenden
würde.
Das Kupfer-Ion neigt dazu, etwas Hintergrund-Interferenz wegen Oxidation
des Farbstoffs in der Abwesenheit von Kreatinin zu verursachen.
Demzufolge können
Cu(I)-Salze nicht verwendet werden.
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Geeignete
oxidierbare Indikatoren schließen
z.B. Benzidin, o-Toluidin, ein 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin, worin
die Alkyl-Gruppe 1 bis ca. 6 Kohlenstoffatome einschließt, o-Dianisidin,
2,7-Diaminofluoren, Bis(N-ethylchinol-2-on)azin,
(N-Methylbenzthiazol-2-on)-(1-ethyl-3-phenyl-5-methyltriazol-2-on)azin oder Kombinationen davon
ein.
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Geeignete
Hydroperoxide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Cumolhydroperoxid,
5-Butylhydroperoxid, Diisopropylbenzohydroperoxid, 1-Hydroxycyclohexan-1-hydroperoxid,
2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, p-Menthanhydroperoxid, 1,9-Diisopropylbenzolmonohydroperoxid,
p-t-Butylisopropylbenzolhydroperoxid, 2-(α-Hydroperoxyisopropyl)-6-isopropylnaphthalin,
Tetralinhydroperoxid oder Kombinationen davon ein.
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In
typischer Weise wird das Reagenssystem, das das lösliche Kupfersalz,
Hydroperoxid und einen oxidierbaren Indikator umfasst, in Wasser
gelöst.
Allerdings können
organische Lösungsmittel
unter der Voraussetzung in das System eingebracht werden, dass sie
den Assay-Mechanismus nicht stören.
Die Konzentration des Hydroperoxids und des oxidierbaren Indikators
liegen im Normalfall im Bereich von 10 bis 150 mM, wobei ein Bereich
von 60 bis 100 mM bevorzugt ist.
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Zur
Durchführung
der Erfindung kann der Assay entweder im Nass- oder im Trocken-(Teststreifen)-Format
durchgeführt
werden. Zur Ausführung
des Assays wird die Testprobe mit dem Kupfersalz, z.B. mit Kupferzitrat,
dem Farbstoff und dem Hydroperoxid bei einem gepufferten pH-Wert,
vorzugsweise von 9,0 bis 9,0, durch die Anwendung eines Reagensstreifens
oder von wässrigen
und Acetonitril-Lösungen
der Reagenzien vermischt. Reagensstreifen werden in herkömmlicher
Weise hergestellt, wobei ein absorbierender Träger in eine wässrige Lösung des
Kupfersalzes und von Puffern getaucht, der Träger getrocknet und dann in
eine organische Lösung
des Farbstoffs und des Hydroperoxids getaucht wird, worauf das Ganze
getrocknet wird.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch weiter
erläutert:
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Beispiel I
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Ein
Teststreifen zum Nachweis von Kreatinin wurde durch ein zweistufiges
Tauch-Verfahren hergestellt, wobei ein Streifen aus Whatman 3 mm
Filterpapier in eine erste Tauch-Lösung getaucht, bei 100°C 6 bis 8
min lang getrocknet und dann in eine zweite Tauch-Lösung unter
anschließender
Trocknung getaucht wurde. Die ersten und zweiten Tauch-Lösungen wurden
wie folgt zubereitet: 1.
Tauch-Lösung
Komponente | Konzentration |
CuSO4 | 30
mM |
Zitrat | 50
mM |
Glyceryl-2-phosphat
als Puffer | 750
mM |
Aerosol
IB-95 als oberflächenaktives
Mittel (Pflatz & Bayer) | 1,5%
(G/V) |
pH | 6,80 |
Wasser | |
2.
Tauch-Lösung
Komponente | Konzentration |
3,3';5,5'-Tetramethylbenzidin
(TMB) | 33
mM |
Diisopropylbenzoldihydroperoxid
(DBDH) | 80
mM |
Polymer:
Plasdone als Separator/Stabilisierer 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on | 3
mM |
Ethyl-Orange | 0,032
% (G/V) |
95%iger
Alkohol | |
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Dieser
Streifen wurde bezüglich
seiner Fähigkeit
zur Steigerung der Hämoglobin-Resistenz
der Formulierung durch visuelle und instrumentelle Analyse getestet.
Ein 50 mg/dL-Kreatinin-Urin-Standard wurde mit 1 mg/dL Hämoglobin
versetzt. Der 50 mg/dL-Standard mit Hämoglobin wurde instrumentell
unter Anwendung eines CLINITEK 50- und CLINITEK 100-Reflexionsspektrometers
und visuell unter Anwendung einer Kreatinin-Farbkarte gegen Urin-Standards,
enthaltend 50, 100, 200 und 300 mg/dL Kreatinin, verglichen. Bei
Raumtemperatur aufbewahrte und belastete (1 Woche bei 60°C) Streifen
wurden bewertet. Mit dem Streifen wurde gefunden, dass er ein 50
mg/dL-Ergebnis für
eine Urinprobe ergab, die 50 mg/dL Kreatinin und 10 mg/dL Hämoglobin
enthielt. Dies steht in Kontrast zum gleichen Kreatinin-Reagens,
bei dem das Pyrazol fehlt, welches ein Ergebnis von 300 mg/dL mit
einem Urin erzeugte, der 50 mg/dL Kreatinin und 1 mg/dL Hämoglobin
enthielt. Das Ziel dieses Versuches war ein zweifaches. Erstens
sollte ein Assay erzielt werden, bei welchem die Ergebnisse, die
mit einer Probe mit 50 mg/dL Kreatinin und 1 mg/dL Hämoglobin
erhalten werden, die gleichen wie die für 50 mg/dL Kreatinin und kein
Hämoglobin
wären,
und zweitens sollte eine Reaktivitätssteigerung um nicht mehr
als 1 Niveau für
bis zu 10 mg/dL Hämoglobin
(d.h. ≤100
mg/dL Kreatinin) am Niveau von 50 mg/dL Kreatinin bewerkstelligt
werden.
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Beispiel II
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Weitere
Pyrazol-Verbindungen wurden bezüglich
ihrer Fähigkeit
zur Erstellung einer Resistenz gegen die Tendenz des Hämoglobins
zur Oxidation des TMB-Indikators in gleicher Weise wie der in Beispiel
I beschriebenen untersucht. Die Pyrazol-Konzentration in der zweiten
Tauch-Lösung,
die zur Herstellung des Streifens eingesetzt wurde, betrug in typischer
Weise 0,5 bis 5 mM. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2
angegeben: Tabelle
2 In
der Kreatinin-Formulierung untersuchte Pyrazol-Derivate
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Aus
den Daten der Tabelle 2 ist ermittelbar, dass sowohl Phenbutazon
als auch Oxyphenbutazon belegen, dass zwei aromatische Gruppe an
2 Ring-Stickstoffe
gebunden sein können,
die zu Carbonyl-Gruppen benachbart sind. Die Ergebnisse mit 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on
und mit 4-(3-Methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoesäure zeigen
für beide,
dass nur 1 Carbonyl- und
1 aromatische Gruppe an einen Ring-Stickstoff gebunden zu sein brauchen,
um die gewünschte
Hämoglobin-Resistenz
zu bewirken.
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Die
Ergebnisse mit Antipyren und Phenidon belegen, dass eine aromatische
Gruppe an den am nächsten
zum Carbonyl gelegenen Stickstoff gebunden sein muss, um das gewünschte Ergebnis
zu liefern, wogegen die Aktivität
von 5-Amino-1-phenyl-4-pyrazolcarboxamid und von 3-Methyl-1-phenylpyrazol
zeigen, dass das zum Stickstoff benachbarte Carboxyl notwendig ist,
wogegen das Misslingen mit 3-Amino-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on zeigt,
dass ein Amin-Substituent
zur Herabsetzung der Hämoglobin-Interferenz
schädlich ist.
Schließlich
belegen die Ergebnisse mit 1-(9-Nitrophenyl)-3-pyrolidino-2-pyrazolin-5-on, dass
die Nitro-Substitution oder das Vorliegen einer Elektron-abziehenden
Gruppe am aromatischen Ring das Pyrazol ineffektiv zur Herabsetzung
der Hämoglobin-Interferenz
machen.