DE602005001445T2 - N-terminal monopegylierte menschliche wachstumshormon-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung beansprucht die Priorität der US-Anmeldung Nr. 10/771895 , eingereicht am 4. Februar 2004, welche in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist, als wäre sie hierin beschrieben.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine chemische Modifikation, einschließlich PEGylierung, von humanem Wachstumshormon (hGH) und Agonistenvarianten davon, durch welche die chemischen und/oder physiologischen Eigenschaften von hGH verändert werden können. Das PEGylierte hGH kann eine erhöhte Verweildauer im Plasma, eine verringerte Clearance-Rate, eine verbesserte Stabilität, eine verringerte Antigenität, eine verringerte PEGylierungs-Heterogenität oder eine Kombination davon aufweisen. Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch Verfahren zur Modifikation von hGH. Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend das modifizierte hGH. Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung des modifizierten hGH für die Behandlung von Wachstums- und Entwicklungsstörungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Humanes Wachstumshormon (hGH) ist ein Protein, umfassend eine Einzelkette von 191 Aminosäuren, quervernetzt durch zwei Disulfidbrücken, und die monomere Form hat ein Molekulargewicht von 22 kDa. Human-GH wird durch die Hypophyse sekretiert, und es kann auch mittels rekombinanter Gentechnologie produziert werden. hGH wird Wachstum in allen Körpergeweben bewirken, die zum Wachstum befähigt sind. hGH spielt eine wichtige Rolle nicht nur beim Fördern des Wachstums in der Wachstumsphase bei Menschen, sondern auch beim Aufrechterhalten der normalen Beschaffenheit bzw. Zusammensetzung des Körpers, des normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus (K. Barneis und U. Keller, Baillieres Clin. Endocrinlo. Metab. 10: 337 (1996)).
  • Rekombinantes hGH ist seit mehreren Jahren kommerziell verfügbar. Zwei Typen von therapeutisch zweckmäßigen rekombinanten hGH-Zubereitungen sind auf dem Markt vorhanden: das Authentische, z.B. GenotropinTM oder NutropinTM, und ein Analogon mit einem zusätzlichen Methioninrest an dem N-terminalen Ende, z.B. SomatonormTM. hGH wird verwendet, um das lineare Wachstum bei Patienten mit hypophysärem Kleinwuchs bzw. Kleinwuchs mit Hypopituitarismus-Bezug ("hypo pituitary dwarfism"), auch bezeichnet als Wachstumshormonmangel ("Growth Hormone Deficiency") (GHD) oder Turner-Syndrom, zu stimulieren, aber andere Indikationen wurden ebenfalls vorgeschlagen, einschließlich Langzeitbehandlung von Wachstumsrückstand bzw. Wachstumsstillstand ("growth failure") bei Kinder, die für Ihr Gestationsalter zu klein ("short for gestational age") (SGA) geboren wurden, zur Behandlung von Patienten mit Prader-Willi-Syndrom (PWS), chronischer Niereninsuffizienz ("chronic renal insufficiency") (CRI), Aids-Syndrom ("aids wasting") und beim Alter. Patienten mit GH- Mangel bei Erwachsenen („adult GH deficiency") (aGHD) haben verschiedene Probleme, wie charakteristische Veränderungen in der Zusammensetzung des Körpers, einschließlich Zunahme bei Fettmasse, Abnahme der fettfreien Körpermasse und der extrazellulären Flüssigkeit und Verringerung der Knochenmineraldichte, metabolische Abnormalitäten der Lipide und kardiovaskuläre Dysfunktion. Viele dieser Probleme werden durch hGH-Ersatztherapie verbessert (J. Verhelst, J. und R. Abs. Drugs.; 62: 2399 (2002)).
  • Eine biologische Hauptwirkung eines Wachstumshormons (GH) ist es, das Wachstum bei jungen Säugern und die Aufrechterhaltung der Gewebe bei älteren Säugern zu fördern. Die betroffenen Organsysteme schließen das Skelett, Bindegewebe, Muskeln und Viszera, wie Leber, Intestinum und Nieren, ein. Wachstumshormone üben ihre Wirkung über Wechselwirkung mit spezifischen Rezeptoren auf der Membran der Zielzellen aus. hGH ist ein Mitglied einer Familie von homologen Hormonen, die Plazentalaktogene, Prolaktine und andere genetische und Speziesvarianten oder Wachstumshormone einschließen (Nicoll, C. S. et al. (1986), Endocrine Reviews, 7: 169). hGH ist unter diesen dahingehend ungewöhnlich, dass es eine breitere Speziesspezifität aufweist und entweder an den klonierten somatogenen (Leung, D. W. et al. [1987] Nature 330; 537) oder den Prolaktinrezeptor (Boutin, J. M., et al. [1988], Cell, 53: 69) bindet. Das klonierte Gen für hGH wurde in einer sekretierten Form in Escherichia coli exprimiert (Chang, C. N. et al. [1987], Gene, 55: 189), und seine DNA- und Aminosäuresequenz wurden angegeben (Goeddel et al. [1979], Nature 281: 544; Gray et al. [1985], Gene 39: 247).
  • Das humane Wachstumshormon (hGH) ist an vielen (Teilen) der Regulierung des normalen menschlichen Wachstums und der normalen menschlichen Entwicklung beteiligt. Dieses Hypophysenhormon weist eine Vielzahl von biologischen Wirkungen auf, einschließlich unter anderem lineares Wachstum (Somatogenese), Laktation, Aktivierung von Makrophagen, Insulin-artige und diabetogene Wirkungen (Chawla, R. K. (1983), Ann. Rev. Med., 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988), Science, 239, 769; Thomer, M. O. et al. (1988), J. Clin. Invest., 81: 745). Wachstumshormonmangel bei Kinder führt zu Kleinwuchs, der für mehr als ein Jahrzehnt erfolgreich mittels exogener Verabreichung von hGH behandelt wurde.
  • Bei Erwachsenen sowie bei Kindern hält hGH eine normale Körperzusammensetzung aufrecht, indem es die Stickstoffrückhaltung und die Stimulierung des Skelettmuskelwachstums erhöht, und durch Mobilisierung von Körperfett. Viszerales Fettgewebe ist besonders reaktiv gegenüber hGH. Zusätzlich zu einer erhöhten Lipolyse vermindert hGH die Aufnahme von Triglyceriden in Körperfettspeicher. Die Serumkonzentrationen von IGF-I (Insulin-artiger Wachstumsfaktor I) und IGFBP3 (Insulin-artiger Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 3) werden durch hGH erhöht.
  • Das humane Wachstumshormon (hGH) ist ein einzelkettiges Polypeptid, bestehend aus 191 Aminosäuren (Molekulargewicht 21.500). Disulfidbindungen verknüpfen die Positionen 53 und 165 und die Positionen 182 und 189. Niall, Nature, New Biology, 230: 90 (1971). hGH ist ein wirksames Anabolikum, insbesondere aufgrund der Rückhaltung von Stickstoff, Phosphor, Kalium und Calcium. Die Behandlung von Ratten mit Hypophysektomie mit GH kann mindestens einen Teil der Wachstumsrate dieser Ratten wiederherstellen. Moore et al., Endocrinology, 122: 2920–2926 (1988). Zu seinen auffallendsten Wirkungen bei Subjekten mit Hypopituitarismus (mit GH-Mangel) gehört das lineare Wachstum von Knochen-Epiphysenfugenknorpeln ("bone-growth-plate-cartilage"), was in einer erhöhten Körpergröße resultiert. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
  • hGH bewirkt eine Vielfalt von physiologischen und metabolischen Wirkungen in verschiedenen Tiermodellen, einschließlich lineares Knochenwachstum, Laktation, Aktivierung von Makrophagen, Insulin-artige und diabetogene Wirkungen und andere (R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); O. G. P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C. K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. O. Thomer und M. L. Vance, J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); J. P. Hughes und H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). Es wurde berichtet, dass insbesondere bei Frauen nach der Menopause die GH-Sekretion mit dem Alter abnimmt. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229–235 (1990); Takahashi et al.; Neuroendocrinology M, L6-137-142 (1987). Siehe auch Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361–1369 (1981), und Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Darüber hinaus besteht ein Bericht, dass einige der Manifestationen des Alters, einschließlich verminderter fettfreier Körpermasse, Zunahme der Fettgewebemasse und des Dünnerwerdens der Haut, durch eine GH-Behandlung von dreimal pro Woche vermindert werden können. Siehe z.B. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1–6 (1990), und den begleitenden Artikel in derselben Zeitschriftenausgabe von Dr. Vance (S. 52–54). Diese biologischen Wirkungen stammen aus der Wechselwirkung zwischen hGH und spezifischen Zellrezeptoren. Zwei verschiedene humane Rezeptoren wurden kloniert, der hGH-Leberrezeptor (D. W. Leung et al., Nature, 330: 537 (1987)) und der humane Prolaktinrezeptor (J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinology, 3: 1455 (1989)). Jedoch ist es wahrscheinlich, dass andere vorhanden sind, einschließlich dem humanen Plazentalaktogen-Rezeptor (M. Freemark, M. Comer, G. Komer und S. Handwerger, Endocrinol., 120: 1865 (1987)). Diese homologen Rezeptoren enthalten eine glykosylierte extrazelluläre Hormonbindungsdomäne, eine einzelne Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne, die sich in Sequenz und Größe merklich unterscheidet. Es wird davon ausgegangen, dass ein oder mehrere Rezeptoren eine bestimmende Rolle in der physiologischen Reaktion auf hGH spielt/spielen.
  • Es wird allgemein beobachtet, dass physiologisch aktive Proteine, die einem Körper verabreicht werden, ihre pharmakologische Aktivität bzw. Wirksamkeit nur für eine kurze Zeitdauer aufgrund ihrer hohen Clearance-Rate in dem Körper zeigen können. Darüber hinaus kann die relative Hydrophobie dieser Proteine ihre Stabilität und/oder Löslichkeit begrenzen.
  • Zum Zweck des Verringerns der Clearance-Rate, des Verbesserns der Stabilität oder des Beseitigens der Antigenität von therapeutischen Proteinen wurden einige Verfahren vorgeschlagen, in denen die Proteine chemisch mit wasserlöslichen Polymeren modifiziert sind.
  • Die chemische Modifizierung dieses Typs kann wirksam den physikalischen Kontakt eines proteolytischen Enzyms mit dem Proteingerüst selbst blockieren und somit den Abbau verhindern. Die chemische Bindung bzw. Anfügung bestimmter wasserlöslicher Polymere kann wirksam die Nieren-Clearance aufgrund eines erhöhten hydrodynamischen Volumens des Moleküls verringern. Zusätzliche Vorteile schließen unter bestimmten Umständen das Erhöhen der Stabilität und der Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins, das Erhöhen der Löslichkeit und das Verringern der Immunogenität ein. Poly(alkylenoxid), namentlich Poly(ethylenglykol) (PEG), ist eine derartige chemische Gruppierung, die in der Herstellung von therapeutischen Proteinprodukten verwendet wurde (wobei das Verb "PEGylieren" bedeutet, mindestens ein PEG-Molekül daran zu binden). Es wurde gezeigt, dass die Anfügung bzw. Bindung von Poly(ethylenglykol) gegen Proteolyse schützt, Sada et al., I Fermentation Bioengineering, 71: 137–139 (1991), und Verfahren zur Anfügung bestimmter Poly(ethylenglykol)-Gruppierungen sind verfügbar. Siehe US-Patent Nr. 4 179 337 , Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", erteilt am 18. Dezember 1979, und US-Patent Nr. 4 002 531 , Royer, "Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", erteilt am 11. Januar 1977. Für einen Überblick siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg., S. 367–383 (1981)).
  • Andere wasserlösliche Polymere wurden verwendet, wie Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(-1,3-dioxolan), Poly(-1,3,6-trioxan), Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere).
  • Eine Anzahl von Beispielen von PEGylierten therapeutischen Proteinen wurde beschrieben. ADAGEN®, eine PEGylierte Formulierung von Adenosindeaminase, ist zum Behandeln einer schweren kombinierten Immunmangelkrankheit zugelassen. ONCASPAR®, eine PEGylierte L-Asparaginase, wurde zum Behandeln von hypersensitiven ALL-Patienten zugelassen. PEGylierte Superoxiddismutase war in klinischen Versuchen zum Behandeln von Kopfverletzung. PEGyliertes α-Interferon ( US 5 738 846 , 5 382 654 ) wurde zum Behandeln von Hepatitis zugelassen; über PEGylierte Glucocerebrosidase und PEGyliertes Hämoglobin wurde berichtet, dass sie sich in vorklinischen Tests befinden. Ein anderes Beispiel ist PEGyliertes IL-6, EP 0 442 724 , mit dem Titel "Modifiziertes hIL-6", welches Poly(ethylenglykol)-Moleküle offenbart, die an IL-6 angefügt wurden.
  • Ein anderes spezifisches therapeutisches Protein, welches klinisch modifiziert wurde, ist der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF). G-CSF induziert die rasche Proliferation und Freisetzung von neutrophilen Granulozyten in den Blutstrom und stellt dadurch eine therapeutische Wirkung beim Bekämpfen von Infektion bereit. Die europäische Patentveröffentlichung EP 0 401 381 , veröffentlicht am 12. Dezember 1990, mit dem Titel "Chemisch modifizierter Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor", beschreibt Materialen und Verfahren zum Herstellen von G-CSF, an den Poly(ethylenglykol)-Moleküle angefügt sind.
  • Über einen modifizierten G-CSF und Analoga davon wird auch in EP 0 473 268 , veröffentlicht am 4. März 1992, mit dem Titel "Pharmazeutische Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung, umfassend ein Polypeptid, kovalent konjugiert an ein wasserlösliches Polymer", berichtet, wobei die Verwendung verschiedener G-CSF und Derivate, kovalent konjugiert an ein wasserlösliches Polymerpartikel („particle polymer"), wie Poly(ethylenglykol), angegeben wird. Über ein modifiziertes Polypeptid mit Aktivität eines humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors wird in EP 0 335 423 , veröffentlicht am 4. Oktober 1989, berichtet. In US 5 824 784 werden Verfahren zum N-terminalen Modifizieren von Proteinen oder Analoga davon und resultierende Zusammensetzungen, einschließlich neuer Zusammensetzungen mit N-terminal chemisch modifiziertem G-CSF, bereitgestellt. US 5 824 778 offenbart einen chemisch modifizierten G-CSF.
  • Bei Poly(ethylenglykol) wurde eine Vielfalt von Mitteln verwendet, um die Poly(ethylenglykol)-Moleküle an das Protein anzufügen. Im Allgemeinen werden die Poly(ethlyenglykol)-Moleküle über eine reaktive Gruppe, die auf dem Protein gefunden wird, mit dem Protein verbunden.
  • Aminogruppen, wie jene bei Lysinresten oder am N-Terminus, sind für eine solche Anfügung zweckmäßig. Z.B. gibt Royer ( US-Patent Nr. 4 002 531 , oben) an, dass eine reduktive Alkylierung zur Anfügung von Poly(ethlyenglykol)-Molekülen an ein Enzym verwendet wurde. Chamow et al., Bioconjugate Chem., 5: 133–140 (1994), berichten über die Modifizierung von CD4-Immunoadhäsin mit Monomethoxypoly(ethlyenglykol)aldehyd über reduktive Alkylierung. Die Autoren berichten, dass 50% des CD4-IG unter Bedingungen, die eine Kontrolle über das Ausmaß der PEGylierung ermöglichen, MePEG-modifiziert wurden. Id. auf Seite 137. Die Autoren berichten auch, dass die in vitro-Bindungsfähigkeit des modifizierten CD4-IG (an das Protein gp 120) mit einer Rate abnahm, die mit dem Ausmaß der MePEGylierung korrelierte. Ibid. US-Patent Nr. 4 904 584 , Shaw, erteilt am 27. Februar 1990, betrifft die Modifizierung der Anzahl von Lysinresten in Proteinen zur Anfügung von Poly(ethylenglykol)-Molekülen über reaktive Amingruppen.
  • WO 93/00109 betrifft ein Verfahren zum Stimulieren eines Gewebes eines Säugers oder Vogels, das auf GH reagiert, umfassend das Aufrechterhalten einer kontinuierlichen, wirksamen Plasma-GH-Konzentration für eine Dauer von 3 oder mehr Tagen. Als ein Weg zum Erreichen einer derartigen Plasmakonzentration wird die Verwendung von GH, gekuppelt an eine makromolekulare Substanz, wie PEG (Polyethylenglykol), angegeben. Über das Kuppeln an eine makromolekulare Substanz wird angegeben, dass es in einer verbesserten Halbwertszeit resultiert. Über PEGyliertes humanes Wachstumshormon wurde in WO 93/00109 berichtet, wobei mPEG-Aldehyd-5000 und mPEG-N-Hydroxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) verwendet wurden. Die Verwendung von mPEG-NHS resultierte in heterogenen Gemischen von mehrfach PEGylierten Formen von hGH. WO 93/00109 offenbart auch die Verwendung von mPEG-Maleimid, um Cystein-hGH-Varianten zu PEGylieren.
  • WO 99/03887 offenbart eine Cysteinvariante eines Wachstumshormons, die PEGyliert ist. Von diesem Konjugat, bezeichnet als BT-005, wird behauptet, dass es wirksamer beim Stimulieren von Gewichtszunahme bei Ratten mit Wachstumshormonmangel ist und eine längere Halbwertszeit als hGH hat.
  • Über PEGyliertes humanes Wachstumshormon wurde auch bei Clark et al. berichtet, wobei Succinimidylester von carboxymethyliertem PEG verwendet wurde (Journal of Biological Chemistry, 271: 21969–21977, 1996). Clark et al. beschreiben Derivate von hGH mit zunehmender Größe unter Verwendung von mPEG-NHS-5000, welches selektiv Konjugate mit primären Aminen bildet. Zunehmende Level von PEG-Modifizierung verringerten die Affinität für seinen Rezeptor und erhöhten den EC50(-Wert) in einem Zell-basierten Assay bis zu 1500-fach. Olson et al., Polymer Preprints, 38: 568–569, 1997, offenbaren die Verwendung von N-Hydroxysuccinimid (NHS)-PEG und Succinimidylpropionat (SPA)-PEG, um mehrfach PEGylierte hGH-Spezies zu erhalten.
  • WO 94/20069 offenbart in Voraussicht PEGyliertes hGH als Teil einer Formulierung zur pulmonalen Abgabe.
  • US 4 179 337 offenbart Verfahren zum PEGylieren von Enzymen und Hormonen, um physiologisch aktive bzw. wirksame, nicht-immunogene, wasserlösliche Polypeptidkonjugate zu erhalten. GH wird als ein Beispiel eines Hormons, das PEGyliert werden soll, genannt.
  • EP 458064 A2 offenbart die PEGylierung von eingeführten oder natürlicherweise vorhandenen Cysteinresten in Somatotropin. EP 458064 A2 erwähnt weiterhin den Einbau von zwei Cysteinresten in eine Schleife, genannt die Omegaschleife, von der angegeben wird, dass sie bei den Resten 102–112 in Rinder-Somatotropin vom Wildtyp lokalisiert ist; spezieller offenbart EP 458064 A2 die Substitution der Reste mit den Nummern 102 und 112 des Rinder-Somatotropins von Ser durch Cys bzw. Tyr durch Cys.
  • WO 95/11987 schlägt die Anfügung von PEG an die Thiogruppe eines Cysteinrests vor, der entweder in dem Ausgangsmolekül vorhanden ist oder durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt wurde. WO 95/11987 betrifft die PEGylierung von Protease Nexin-1, jedoch wird eine PEGylierung im Allgemeinen von hGH und anderen Proteinen ebenfalls vorgeschlagen.
  • WO 99/03887 offenbart z.B. Wachstumshormon, modifiziert durch Insertion von zusätzlichen Cys-25-Serinresten („cys 25 serine residues") und die Anfügung von PEG an die eingeführten Cysteinreste.
  • WO 00/42175 betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen, die freie Cysteinreste zur Anfügung von PEG enthalten. WO 00/42175 offenbart die folgenden Muteine von hGH: T3C, S144C und T148C, und die Cystein-PEGylierung davon.
  • WO 97/11178 (sowie US 5 849 535 , US 6 004 931 und US 6 022 711 ) betrifft die Verwendung von GH-Varianten als Agonisten oder Antagonisten von hGH. WO 97/11178 offenbart auch die PEGylierung von hGH, einschließlich Lysin-PEGylierung und der Einführung oder dem Ersetzen von Lysin (z.B. K168A und K172R). WO 97/11178 offenbart auch die Substitution G120K.
  • WO 03/044056 offenbart eine Vielfalt von PEGylierten hGH-Spezies, einschließlich einem verzweigten 40K-PEG-Aldehyd-hGH-Konjugat.
  • Die früheren Berichte von PEGyliertem hGH erfordern die Anfügung von mehreren PEGs, was in unerwünschter Produktheterogenität resultiert, um ein hydrodynamisches Volumen von größer als dem Molekulargewichtsausschluss von 70K der Nierenfiltration, wie beschrieben, zu erreichen (Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem., 263: 15064–15070, 1988).
  • Die gegenwärtige Verabreichung von rhGH ist täglich für eine lange Zeitdauer, und daher wäre eine weniger häufige Verabreichung sehr wünschenswert. Ein hGH-Molekül mit einer längeren Zirkulationshalbwertszeit bzw. Halbwertszeit im Kreislauf würde die Anzahl der notwendigen Verabreichungen verringern und möglicherweise optimalere therapeutische hGH-Spiegel mit damit einhergehender erhöhter therapeutischer Wirkung bereitstellen.
  • Trotz einer Anzahl von Versuchen, hGH zu PEGylieren, gibt es noch immer einen nicht erfüllten Bedarf für ein PEGyliertes hGH-Molekül mit den geeigneten Eigenschaften, um ein brauchbares kommerzielles Produkt zu sein. Die vorliegende Anmeldung beschreibt PEG-hGH-Konjugate mit einem einzelnen PEG, das vorherrschend an das N-terminale Phenylalanin von hGH gebunden ist, was Vorteile gegenüber anderen PEG-hGH-Konjugaten bereitstellt. Die Anfügung bzw. Bindung mehrerer PEGs mit niedrigem Molekulargewicht (5 Kd) an α- oder ε-Aminostellen (N-Terminus und neun Lysine in hGH) unter Verwendung von mPEG-Aldehyd-5000 oder mPEG-N-Hydroxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) wurde in WO 93/00109 , Clark et al. (Journal of Biological Chemistry, 271: 21969–21977, 1996) und Olson et al. (Polymer Preprints, 38: 568–569, 1997) beschrieben. Dies resultiert in einer heterogenen Population. Als Veranschaulichung sei angemerkt, dass hGH mit neun Lysinen einige Moleküle aufweisen kann, die zehn PEGs daran gebunden haben, sowie einige mit neun, einige mit acht, einige mit sieben, einige mit sechs, einige mit fünf, einige mit vier, einige mit drei, einige mit zwei, einige mit einem und einige mit null. Und unter den Molekülen mit mehreren (PEGs) ist es möglich, dass das PEG auf verschiedenen Molekülen nicht an der gleichen Stelle gebunden ist. Diese resultierende Heterogenität ist von Nachteil, wenn ein therapeutisches Produkt entwickelt wird, wobei die Konjugation, Reinigung und Charakterisierung schwierig, kostenintensiv und sehr unreproduzierbar gemacht wird. Ein anderer Ansatz ( WO 00/42175 ) war es, hGH-Varianten zu verwenden, die freie Cysteinreste zur Anfügung von PEG enthalten. Jedoch kann diese Herangehensweise zu falsch gefaltetem Protein führen, das falsch gepaarte Disulfidbindungen hat und in einem heterogenen PEGylierten Produkt resultiert, das das PEG gebunden an einige oder alle der Cysteine aufweist. Wenn mehrere PEGs an mehrere Stellen gebunden sind, kann dies zu Molekülen fuhren, die weniger stabile Bindungen zwischen dem PEG und den verschiedenen Stellen haben, welche mit verschiedenen Raten bzw. Geschwindigkeiten dissoziiert werden können. Dies macht es schwierig, die Pharmakokinetiken des Produktes genau vorherzu sagen, was in einer ungenauen Dosierung resultiert. Ein heterogenes Produkt wirft auch unerwünschte Probleme beim Erhalten einer behördlichen Zulassung für das therapeutische Produkt auf.
  • Daher wäre es wünschenswert, ein PEGyliertes hGH-Molekül zu haben und zu verwenden, das ein einzelnes PEG, gebunden an einer einzigen Stelle, aufweist. Die vorliegende Erfindung richtet sich in einer Anzahl von Wegen an dieses Bedürfniss.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von chemisch modifiziertem hGH und Agonistenvarianten davon, die zumindest eine verbesserte chemische oder physiologische Eigenschaft aufweisen, ausgewählt aus, aber ohne Einschränkung darauf, verringerter Clearance-Rate, erhöhter Verweildauer im Plasma, erhöhter Stabilität, verbesserter Löslichkeit und verringerter Antigenität. Wie unten detaillierter beschrieben wird, weist die vorliegende Anwendung eine Anzahl von Aspekten auf, die chemisch modifizierende Polypeptide betreffen, einschließlich, aber ohne Einschränkung darauf, hGH und Agonistenvarianten davon, sowie spezifische Modifikationen unter Verwendung einer Poly(ethlyenglykol)butyraldehyd-Gruppierung.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch Verfahren zum Herstellen des chemisch modifizierten hGH und von Agonistenvarianten davon. Insbesondere beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Herstellen eines chemisch modifizierten hGHs unter Verwendung von Butyraldehyd, welches in einer größeren N-terminalen Selektivität der Anfügung bzw. Bindung resultiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, umfassend das chemisch modifizierte hGH und Agonistenvarianten davon, allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des chemisch modifizierten hGH und von Agonistenvarianten davon aus der vorliegenden Erfindung, allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Prävention und/oder Behandlung von Störungen und/oder Krankheiten, bei denen GH-Behandlung zweckmäßig ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein HPLC-Profil ("HPLC tracing") einer Kartierungsanalyse nach tryptischem Verdau ("tryptic map analysis") der Reaktion von hGH und 40K verzweigtem Butyrylaldehyd-hGH oder 40K verzweigtem Aldehyd-hGH. Das obere Feld ist die Kartierung nach tryptischem Verdau von 40K verzweigtem Butyraldehyd-hGH. Das mittlere Feld ist die Kartierung nach tryptischem Verdau von 40K verzweigtem Aldehyd-hGH. Das untere Feld ist die Kartierung nach tryptischem Verdau von nicht-PEGyliertem hGH. T1 ist das N-terminale Fragment nach tryptischem Verdau.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem Wachstumshormon (SEQ ID NO: 1).
  • 3 zeigt die Wirksamkeit von 40K verzweigtem Butyraldehyd-hGH in einem Assay zur Gewichtszunahme bei Ratten. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit Hypophysektomie wurden im Alter von 4–5 Wochen (100–125 g) von Harlan Labs erworben. Beim Eintritt in die Tier-Einrichtungen wurden die Tiere bei einer konstanten Raumtemperatur von 80°F gehalten und für 4–10 Tage täglich gewogen, um die Basiswachstumsraten zu etablieren. Beginnend am Tag 0 erhielten Ratten (~100 g) in Kontrollgruppen dann eine tägliche subkutane Injektion von ~0,3 mg/kg hGH (gefüllte Kreise) oder PBS (ungefüllte Kreise), und zwar für elf aufeinander folgende Tage. Die 40K verzweigtes Butyraldehyd-hGH-Testgruppe (gefüllte Quadrate) erhielt Einzeldosen von 1,8 mg/kg PHA-794428 an den Tagen 0 und 6. Es waren 8–10 Tiere pro Gruppe. Das durchschnittliche Wachstum +/–SEM ist aufgetragen.
  • 4 zeigt die Dosis-abhängigen ("Dose-Responsive") wachstumsfördernden Wirkungen von 40K verzweigtem Butyraldehyd-hGH bei Ratten. Diese Wirksamkeitsstudie wurde in einer Weise durchgeführt, die derjenigen ähnlich ist, die bei 3 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass eine variierte Einzeldosis von 40K verzweigtem Butyraldehyd-hGH verabreicht wurde (Tag 0, ausschließlich) und die Studie 6 Tage lief. Kontrollgruppen erhielten einmal täglich Injektionen von entweder 0,3 mg/kg hGH (gefüllte Kreise) oder PBS-Vehikel (ungefüllte Kreise) für sechs aufeinanderfolgende Tage. 40K verzweigtes Butyraldehyd-hGH wurde zu 1,8 mg/kg (gefüllte Quadrate), 0,6 mg/kg (ungefüllte Quadrate), 0,2 mg/kg (gefüllte Dreiecke) oder 0,067 mg/kg (ungefüllte Dreiecke) dosiert. Es waren 8 Tiere pro Gruppe.
  • 5 zeigt das Tibiawachstum als Reaktion auf 40K verzweigtes Butyraldehyd-hGH. Ratten mit Hypophysektomie wurden wie bei 3 beschrieben behandelt. Am Tag 11 wurden die Tiere getötet, die linken Tibiae wurden entfernt und geröntgt, und die Knochenlängen wurden unter Verwendung eines Messschiebers gemessen. Die durchschnittliche Länge +/–SEM ist aufgetragen. Sternchen bezeichnen signifikante Unterschiede von der Kontrollgruppe (p < 0,05).
  • 6 zeigt Plasma-IGF-1-Spiegel für eine Sechs-Tage-Wirksamkeitsstudie. Die Tiere wurden wie bei 4 beschrieben behandelt. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeiten abgenommen, und die Serum-IGF-1-Spiegel wurden mittels ELISA bestimmt. Aufgetragen sind Mittelwerte +/–SEM.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • hGH und Agonistenvarianten davon sind Mitglieder einer Familie rekombinanter Proteine, beschrieben in US 4 658 021 (Methionyl-Human-Wachstumshormon („methionyl human growth hormone") – Met-1-191-hGH) und US 5 633 352 . Ihre rekombinante Produktion und Verfahren zur Verwendung sind detailliert beschrieben in US 4 342 832 , 4 601 980, US 4 898 830 , US 5 424 199 und US 5 795 745 .
  • Jedes gereinigte und isolierte hGH oder eine Agonistenvariante davon, welches durch Wirtszellen, wie E. coli und Tierzellen, produziert wird, die unter Verwendung von Genrekombinationstechniken bzw. rekombinanter Gentechnik transformiert oder transfiziert wurden, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zusätzliche hGH-Varianten werden in US 6 143 523 und WO 92/09690 , veröffentlicht am 11. Juni 1992, beschrieben. Unter diesen ist ein hGH oder eine Agonistenvariante davon, welches/welche mittels des transformierten E. coli hergestellt wurde, besonders bevorzugt. Ein derartiges hGH oder eine Agonistenvariante davon kann in großen Mengen mit hoher Reinheit und Homogenität erhalten werden. Z.B. kann das obige hGH oder die Agonistenvariante davon gemäß einem Verfahren hergestellt werden, das in US 4 342 832 , 4 601 980 , US 4 898 830 , US 5 424 199 und US 5 794 745 offenbart ist. Der Begriff "hat im Wesentlichen die folgende Aminosäuresequenz" bedeutet, dass die obige Aminosäuresequenz eine oder mehrere Aminosäureänderungen (Deletion, Addition, Insertion oder Substitution) einschließen kann, solange derartige Veränderungen keine nachteilige Nicht-Ähnlichkeit bei der Funktion bezüglich hGH oder der Agonistenvariante davon verursachen. Es ist stärker bevorzugt, das hGH oder die Agonistenvariante davon zu verwenden, die im Wesentlichen eine Aminosäuresequenz hat, in der mindestens ein Lysin, eine Asparaginsäure, Glutaminsäure, ein ungepaarter Cysteinrest, eine freie N-terminale α-Aminogruppe oder eine freie C-terminale Carboxylgruppe eingeschlossen ist.
  • Der Begriff "hGH-Polypeptid oder hGH-Protein", wenn hierin verwendet, umfasst alle hGH-Polypeptide, vorzugsweise aus Säugerspezies, stärker bevorzugt aus Menschen und Mäuse-Spezies, sowie ihre Varianten, Analoga, Orthologe, Homologe und Derivate und Fragmente davon, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie das Wachstum in der Wachstumsphase fördern und die normale Körperzusammensetzung, den normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus aufrecht erhalten. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff "hGH-Polypeptid oder -Protein" auf das hGH-Polypeptid von SEQ ID NO: 1 sowie seine Varianten, Homologe und Derivate, die im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit (Wachstumsförderung in der Wachstumsphase und Aufrechterhalten der normalen Körperzusammensetzung, des normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus) aufweisen. Stärker bevorzugt bezieht sich der Begriff "hGH-Polypeptid oder -Protein" auf das Polypeptid von SEQ ID NO: 1.
  • Der Begriff "hGH-Polypeptid-Varianten", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Polypeptide aus der gleichen Spezies, jedoch mit Unterschied zu einem Referenz-hGH-Polypeptid. Allgemein sind die Unterschiede beschränkt, so dass die Aminosäuresequenzen der Referenz und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in manchen Regionen identisch sind. Vorzugsweise sind hGH-Polypeptide zumindestens 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit einem Referenz-hGH-Polypeptid, vorzugsweise dem hGH-Polypeptid aus SEQ ID NO: 1. Mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die z.B. zu mindestens 95% "identisch" zu einer in Frage stehenden Aminosäuresequenz ist, ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des betreffenden Polypeptids („subject polypeptide”) identisch ist mit der in Frage stehenden Sequenz mit der Ausnahme, dass die Sequenz des betreffenden Polypeptids bis zu 5 Aminosäureänderungen pro 100 Aminosäuren der in Frage stehenden Aminosäuresequenz einschließen kann. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an den Amino- oder Carbo xy-terminalen Positionen der Referenzaminosäuresequenz auftreten oder an einer beliebigen Stelle zwischen jenen terminalen Positionen, entweder einzeln eingestreut zwischen den Resten in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die in Frage stehende Sequenz kann eine vollständige Aminosäuresequenz der Referenzsequenz oder ein beliebiges Fragment, spezifiziert wie hierin beschrieben, sein.
  • Derartige hGH-Polypeptidvarianten können natürlich auftretende Varianten, wie natürlich auftretende Allelvarianten, codiert durch eine von mehreren alternativen Formen eines hGH, die einen gegebenen Locus auf einem Chromosom eines Organismus belegen, oder Isoformen, codiert durch natürlich auftretende Spleißvarianten, die aus einem einzelnen Primärtranskript stammen, sein. Alternativ kann eine hGH-Polypeptidvariante eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich auftritt, und die unter Verwendung von Mutagenesetechniken, die im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden kann.
  • Es ist im Fachgebiet bekannt, dass eine oder mehrere Aminosäuren aus dem N-Terminus oder C-Terminus eines bioaktiven Peptides oder Proteins ohne wesentlichen Verlust einer biologischen Funktion deletiert sein können (siehe z.B. Ron et al., (1993), Biol. Chem., 268: 2984–2988; wobei die Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist).
  • Es wird auch durch einen Fachmann von gewöhnlichem Kenntnisstand auf dem Fachgebiet erkannt werden, dass einige Aminosäuresequenzen von hGH-Polypeptiden ohne signifikante Wirkung auf die Struktur oder die Funktion des Proteins variiert sein können. Derartige Mutanten schließen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Substitutionen ein, ausgewählt gemäß der allgemeinen Regeln, die im Fachgebiet bekannt sind, so dass sie eine geringe Auswirkung auf die Aktivität aufweisen. Z.B. wird eine Richtlinie, betreffend die Herstellung phänotypisch stummer Aminosäuresubstitutionen in Bowie et al., (1990), Science, 247: 1306–1310, bereitgestellt, welche hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist, worin die Autoren angeben, dass es zwei Hauptherangehensweisen zum Untersuchen der Toleranz einer Aminosäuresequenz gegenüber einer Veränderung gibt.
  • Das erste Verfahren beruht auf dem Evolutionsprozess, in welchem Mutationen durch natürliche Selektion entweder akzeptiert oder verworfen werden. Die zweite Herangehensweise verwendet die Gentechnologie, um Aminosäureänderungen an spezifischen Positionen eines klonierten hGHs einzuführen, und Selektionen oder Screenings, um die Sequenzen zu identifizieren, welche die Funktionalität beibehalten. Diese Untersuchungen zeigten, dass Proteine überraschend tolerant gegenüber Aminosäuresubstitutionen sind. Die Autoren geben weiterhin an, welche Aminosäureänderungen an einer bestimmten Position des Proteins wahrscheinlich zulässig ("permissive") sind. Z.B. erfordern die meisten verdeckten Aminosäurereste nicht-polare Seitenketten, wohingegen wenige Eigenschaften der Oberflächenseitenketten allgemein konserviert sind. Andere derartige phänotypisch stumme Substitutionen werden in Bowie et al., (1990), supra, und den darin zitierten Literaturverweisen beschrieben.
  • Typischerweise werden als konservative Substitutionen die Austausche einer für eine andere unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Phe, der Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg, und die Austausche zwischen den aromatischen Resten Phe, Tyr angesehen. Zusätzlich stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren allgemein äquivalente Änderungen dar: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
  • Der Begriff hGH-Polypeptid umfasst auch alle hGH-Polypeptide, codiert durch hGH-Analoga, Orthologe und/oder Spezies-Homologe. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "hGH-Analoga" auf hGHs von verschiedenen und nicht miteinander verwandten Organismen bzw. Organismen ohne Bezug, welche die gleichen Funktionen in jedem Organismus ausführen, welche aber nicht von einer Stammstruktur stammen, welche die Vorfahren der Organismen gemeinsam hatten. Anstelle dessen entstanden die analogen hGHs getrennt und entwickelten sich dann später dahingehend, um die gleiche Funktion (oder ähnliche Funktionen) auszuführen. In anderen Worten, analoge hGH-Polypeptide sind Polypeptide mit ziemlich verschiedenen Aminosäuresequenzen, die aber die gleiche biologische Aktivität, nämlich Wachstumsförderung in der Wachstumsphase und Aufrechterhalten der normalen Körperzusammensetzung, des normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus, ausführen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "hGH-Orthologe" auf hGHs innerhalb zweier verschiedener Spezies, deren Sequenzen über ein gemeinsames homologes hGH in einer Stammspezies bzw. Vorläuferspezies miteinander verwandt sind, die sich aber derart entwickelten, dass sie voneinander verschieden wurden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "hGH-Homologe" auf hGHs verschiedener Organismen, welche die gleichen Funktionen in jedem Organismus ausführen und welche von einer Stammstruktur stammen, die die Vorfahren der Organismen gemeinsam hatten. In anderen Worten, homologe hGH-Polypeptide sind Polypeptide mit ziemlich ähnlichen Aminosäuresequenzen, die die gleiche biologische Aktivität ausführen, nämlich Wachstumsförderung in der Wachstumsphase und Aufrechterhalten der normalen Körperzusammensetzung, des normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus. Vorzugsweise können hGH-Polypeptidhomologe als Polypeptide definiert werden, die mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zu einem Referenz-hGH-Polypeptid, vorzugsweise dem hGH-Polypeptid der SEQ ID NO: 1, aufweisen.
  • Somit kann ein hGH-Polypeptid gemäß der Erfindung z.B. Folgendes sein: (i) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise ein konservierter Aminosäurerest) substituiert sind und ein derartiger substituierter Aminosäurerest einer sein kann, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht; oder (ii) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen; oder (iii) eines, in dem das hGH-Polypeptid mit einer anderen Verbindung, wie einer Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids (z.B. Polyethylenglykol) zu erhöhen, fusioniert ist; oder (iv) eines, in dem zusätzliche Aminosäuren mit der obigen Form des Polypeptids fusioniert sind, wie ein IgG-Fc-Fusionsregion-Peptid ("IgG Fc fusion region peptide") oder eine Leader- oder Sekretionssequenz oder eine Sequenz, die zur Aufreinigung der obigen Form des Polypeptids eingesetzt wird, oder eine Pro-Protein-Sequenz.
  • hGH-Polypeptide können Monomere oder Multimere sein. Multimere können Dimere, Trimere, Tetramere oder Multimere, umfassend mindestens fünf monomere Peptideinheiten, sein. Multimere können auch Homodimere oder Heterodimere sein. Erfindungsgemäße Multimere können das Ergebnis von hydrophoben, hydrophilen, ionischen und/oder kovalenten Assoziationen sein und/oder indirekt verknüpft sein, z.B. mittels Liposomenbildung. In einem Beispiel bestehen kovalente Assoziationen zwischen den heterologen Sequenzen, die in einem Fusionsprotein, enthaltend ein hGH-Polypeptid oder ein Fragment davon, enthalten sind (siehe z.B. US-Patent Nr. 5 478 925 , dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist). In einem anderen Beispiel wird ein hGH-Polypeptid oder ein Fragment davon mit einem oder mehreren Polypeptiden, die entweder hGH-Polypeptide oder heterologe Polypeptide sein können, durch Peptidlinker, wie jene, die in dem US-Patent Nr. 5 073 627 (hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben sind, verbunden. Ein anderes Verfahren zum Herstellen multimerer hGH-Polypeptide beinhaltet die Verwendung von hGH-Polypeptiden, die mit einer Leucin-Zipper- oder Isoleucin-Zipper-Polypeptidsequenz fusioniert sind, von denen bekannt ist, dass sie die Multimerisierung der Proteine, in denen sie gefunden werden, fördern, wobei Techniken verwendet werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich der Lehren von WO 94/10308 . In einem anderen Beispiel können hGH-Polypeptide durch Wechselwirkungen zwischen Flag®-Polypeptidsequenzen, die in Fusions-hGH-Polypeptiden, enthaltend Flag®-Polypeptidsequenz, enthalten sind, assoziiert werden. hGH-Multimere können auch unter Verwendung chemischer Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, wie Vernetzung unter Verwendung von Linker-Molekülen und Linker-Molekül-Längenoptimierungstechniken, die im Fachgebiet bekannt sind (siehe z.B. US 5 478 925 ), Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, um eine oder mehrere intermolekulare Vernetzungen zwischen den Cysteinresten zu bilden, die innerhalb der Sequenz der Polypeptide lokalisiert sind, welche wünschenswerterweise in dem Multimer enthalten sein sollen (siehe z.B. US 5 478 925 ), Addition von Cystein oder Biotin an den C-Terminus oder N-Terminus des hGH-Polypeptids und Techniken, um Multimere zu erzeugen, enthaltend eines oder mehrere dieser modifizierten Polypeptide (siehe z.B. US 5 478 925 ), oder eine beliebige der 30 Techniken, um Liposomen, enthaltend hGH-Multimere, zu erzeugen (siehe z.B. US-Patent Nr. 5 478 925 ), erzeugt werden, wobei diese Offenbarungen durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "hGH-Polypeptidfragment" auf jedes Peptid oder Polypeptid, das einen zusammenhängenden Bereich eines Teils der Aminosäuresequenz eines hGH-Polypeptids, vorzugsweise des Polypeptids von SEQ ID NO: 1, umfasst.
  • Spezieller (handelt es sich um) ein hGH-Polypeptidfragment, das mindestens 6, vorzugsweise mindestens 8 bis 10, stärker bevorzugt 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 191, aufeinanderfolgende Aminosäuren eines hGH-Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Das hGH-Polypeptidfragment kann zusätzlich als Unterarten ("sub-genuses") von hGH-Polypeptiden beschrieben werden, die mindestens 6 Aminosäuren umfassen, wobei "mindestens 6" definiert ist als irgendeine ganze Zahl zwischen 6 und der ganzen Zahl, die die C-terminale Aminosäure eines hGH-Polypeptids, einschließlich des Polypeptids von SEQ ID NO: 1, darstellt. Weiterhin eingeschlossen sind Spezies von hGH-Polypeptidfragmenten mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren, wie oben beschrieben, die weiterhin bezüglich ihrer N-terminalen und C-terminalen Positionen beschrieben sind. Ebenfalls umfasst durch den Begriff "hGH-Polypeptidfragment" als individuelle Spezies sind alle hGH-Polypeptidfragmente mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren, wie oben beschrieben, die durch eine N-terminale und C-terminale Position besonders spezifiziert bzw. beschrieben werden können. D.h., jede Kombination einer N-terminalen und C-terminalen Position, die ein Fragment mit einer Länge von mindestens 6 zusammenhängenden Aminosäureresten einnehmen könnte, auf jeder gegebenen Aminosäuresequenz des Sequenzprotokolls oder der vorliegenden Erfindung, ist in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Es wird angemerkt, dass die obige Spezies von Polypeptidfragmenten der vorliegenden Erfindung alternativ durch die Formel "a bis b" beschrieben werden kann, wobei "a" gleich der äußersten N-terminalen Aminosäure-Position ist und "b" gleich der äußersten C-terminalen Aminosäure-Position des Polynucleotids ist, und wobei weiterhin "a" gleich einer ganzen Zahl zwischen 1 und der Anzahl der Aminosäuren einer hGH-Polypeptid-Sequenz minus 6 ist, und wobei "b" gleich einer ganzen Zahl zwischen 7 und der Anzahl der Aminosäuren der hGH-Polypeptidsequenz ist, und wobei "a" eine ganze Zahl ist, die um mindestens 6 kleiner ist als "b".
  • Die obigen hGH-Polypeptidfragmente kann man sich sofort unter Verwendung der obigen Beschreibung vorstellen, und sie sind daher nicht einzeln nur zum Zweck einer unnötigen Verlängerung der Beschreibung aufgelistet. Darüber hinaus müssen die obigen Fragmente nicht notwendigerweise eine biologische hGH-Aktivität aufweisen, obwohl Polypeptide mit diesen Aktivitäten bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind, da sie z.B. in Immunoassays, in der Epitopkartierung, bei der Epitopidentifizierung bzw. dem Epitop-Tagging, als Vakzine und als Molekulargewichtsmarker zweckmäßig waren. Die obigen Fragmente können auch verwendet werden, um Antikörper gegen einen speziellen Teil des Polypeptids zu erzeugen.
  • Ebenfalls umfasst durch den Begriff "hGH-Polypeptidfragment" sind Domänen von hGH-Polypeptiden. Derartige Domänen können schließlich lineare oder strukturelle Motive und Signaturen umfassen, einschließlich, aber ohne Einschränkung darauf, Leucin-Zipper, Helix-Schleife-Helix-Motive, Stellen für posttranslationale Modifikation, die Glykosylierungsstellen, Ubiquitinylierungsstellen, alpha-Helices und beta-Faltblätter, Signalsequenzen, die Signalpeptide codieren, welche die Sekretion der codierten Proteine steuern, Sequenzen, die mit der Regulierung der Transkription in Verbindung gebracht werden, wie Homöoboxen, sauren Bereichen, enzymatisch aktiven Stellen bzw. aktiven Zentren von Enzymen ("enzymatic active sites"), Substratbindungsstellen und Spaltungsstellen von Enzymen. Derartige Domänen können eine besondere biologische Aktivität, wie DNA- oder RNA-Bindung, Sekretion von Proteinen, Regulierung der Transkription, enzymatische Aktivität, Substratbindungsaktivität etc., aufweisen.
  • Eine Domäne hat allgemein eine Größe, umfasst von zwischen 3 und 191 Aminosäuren. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Domänen eine Anzahl von Aminosäuren, die eine ganze Zahl zwischen 6 und 191 ist. Die Domänen können unter Verwendung jeglicher Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, synthetisiert werden, einschließlich jenen, die hierin zur Herstellung von hGH-Polypeptiden, um Anti-hGH-Antikörper zu produzieren, offenbart sind. Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuren, die eine Domäne mit einer speziellen biologischen Aktivität ausmachen, schließen Mutagenesestudien und Assays zum Bestimmen der biologischen Aktivität, die getestet werden soll, ein.
  • Besonders bevorzugte Fragmente im Kontext der vorliegenden Erfindung sind hGH-Polypeptide, die eine wesentliche biologische Aktivität beibehalten, nämlich Wachstumsförderung in der Wachstumsphase und beim Aufrechterhalten der normalen Körperzusammensetzung, des normalen Anabolismus und Lipidmetabolismus.
  • Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide hinsichtlich Motiven, Domänen und/oder Signaturen in Datenbanken unter Verwendung eines beliebigen Computerverfahrens, das den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, durchsucht werden. Suchbare Datenbanken schließen Prosite (Hofmann et al., (1999), Nucl. Acids Res., 27: 215–219; Sucher und Bairoch (1994), Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman et al., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park), Pfam (Sonnhammer et al., (1997), Proteins, 28(3): 405–20; Henikoff et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 228–30; Bateman et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 263–6), Blocks (Henikoff et al., (2000), Electrophoresis, 21(9): 1700–6), Prints (Attwood et al., (1996), Nucleic Acids Res., 24(1): 182–8), Prodom (Sonnhammer und Kahn, (1994), Protein Sci., 3(3): 482–92; Corpet et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 267–9), Sbase (Pongor et al., (1993), Protein Eng., 6(4): 391–5; Murvai et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 260–2), Smart (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864), Dali/FSSP (Holm und Sander, (1996), Nucleic Acids Res., 24(1): 206–9; Holm und Sander, (1997), Nucleic Acid Res., 25(1): 231–4; Holm und Sander, (1999), Nucleic Acids Res., 27(1): 244–7); HSSP (Sander und Schneider (1991), Proteins, 9(1): 56–68), CATH (Orengo et al., (1997), Structure, 5(8): 1093–108; Pearl et al., (2000), Biochem. Soc. Trans., 28(2): 269–75), SCOP (Murzin et al., (1995), 1 Mol. Biol., 247(4): 536–40; Lo Conte et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 257–9), COG (Tatusov et al., (1997), Science, 278, 631: 637; Tatusov et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 33–6), spezifische Familiendatenbanken und Abkömmlinge davon (Nevill-Manning et cd., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5865–5871; Yona et al., (1999), Proteins, 37(3): 360–78; Attwood et al., (2000), Nucleic Acids Res., 28(1): 225–7) ein, wobei jede dieser Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist. Für einen Überblick über verfügbare Datenbanken siehe Ausgabe 1, Band 28 von Nucleic Acid Research (2000), wobei diese Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist.
  • Der Begriff "hGH-Polypeptid-Fragment" umfasst auch Epitop-tragende Fragmente. Diese Epitope können antigene Epitope oder sowohl ein antigenes Epitop als auch ein immunogenes Epitop sein. Ein immunogenes Epitop ist definiert als ein Teil eines Proteins, der eine Antikörperreaktion in vivo auslöst, wenn das Polypeptid das Immunogen ist. Andererseits wird eine Region eines Polypeptids, an die ein Antikörper bindet, als ein antigenes Epitop definiert. Ein Epitop kann so wenig wie 3 Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, welche auf das Epitop beschränkt ist bzw. dafür einzigartig ist. Allgemein besteht ein Epitop aus mindestens 6 derartiger Aminosäuren, und häufiger mindestens 8–19 derartiger Aminosäuren.
  • Ein hGH-Epitop-tragendes Fragment gemäß der Erfindung kann ein beliebiges Fragment, dessen Länge zwischen 6 Aminosäuren und der Gesamtlänge der Sequenz eines hGH-Polypeptids liegt, vorzugsweise ein Fragment zwischen 6 und 50 Aminosäuren, sein. Die Epitop-tragenden Fragmente können entweder durch die Anzahl an zusammenhängenden Aminosäureresten (als Unterart ("sub-genus")) oder durch spezifische N-terminale und C-terminale Positionen (als Spezies), wie oben beschrieben, beschrieben werden.
  • Fragmente, die als Epitope fungieren, können mittels beliebiger konventioneller Mittel produziert werden (siehe z.B. Houghten, (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131–5135, und US 4 631 21 , wobei diese Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind). Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuren, die ein Epitop darstellen, schließen Röntgenkristallographie, zweidimensionale kernmagnetische Resonanz und Epitopkartierung, z.B. das Pepscan-Verfahren, beschrieben von Geysen et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998–4002; in den PCT-Veröffentlichungen WO 84/03564 und WO 84/03506 ein, wobei diese Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind. Ein anderes Beispiel ist der Algorithmus von Jameson und Wolf, (1988), Corp. Appl. Biosci., 4: 181–186 (das genannte Literaturzitat ist durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen). Die Jameson-Wolf-Antigenanalyse kann z.B. unter Verwendung des Computerprogramms PROTEAN unter Verwendung der voreingestellten Parameter (Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc.) durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für den Ausschluss einer beliebigen hGH-Fragmentspezies, beschrieben durch die N-terminalen und C-terminalen Positionen oder einer beliebigen Fragmentunterart, beschrieben durch die Größe bzw. Anzahl der Aminosäurereste, wie oben beschrieben. Eine beliebige Anzahl von Fragmenten, beschrieben durch die N-terminalen und C-terminalen Positionen oder durch die Größe bzw. Anzahl bei den Aminosäureresten, wie oben beschrieben, kann als individuelle Spezies ausgeschlossen werden. Die vorliegende Erfindung sorgt auch für den Ausschluss einer beliebigen hGH-Domäne oder eines beliebigen Epitop-tragenden Fragments in der gleichen Weise.
  • Die hGH-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer beliebigen geeigneten Weise hergestellt werden. Derartige hGH-Polypeptide und Fragmente davon können aus natürlichen Quellen aufgereinigt werden, chemisch synthetisiert werden, durch Rekombinationstechniken, einschließlich in vitro-Translationstechniken, oder Expression in einer rekombinanten Zelle, die befähigt ist, hGH-cDNA zu exprimieren, oder eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden, wobei Techniken verwendet werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind (siehe z.B. "Methods in Enzymology, Academic Press, 1993 "für eine Vielfalt von Verfahren zum Aufreinigen von Proteinen; Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., 2. Aufl., T. E., New York; und Hunkapiller et al., (1984), Nature, 310(5973): 105–11, für chemische Synthesen von Proteinen, und Davis et al., (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Hrsg., Elsevier Press, NY, für Rekombinationstechniken, wobei diese Offenbarungen durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind). Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und können teilweise oder vorzugsweise im Wesentlichen aufgereinigt sein.
  • Die Begriffe "Polynucleotide mit mindestens x% Identität mit einem Referenzpolynucleotid" und "Polypeptide mit x% Identität mit einem Referenzpolypeptid" umfassen Polynucleotide oder Polypeptide, deren Rest (Nucleotid- bzw. Aminosäure-)-Sequenz einen Identitätsprozentsatz, wie unten definiert, aufweist, der gleich oder höher als x ist, verglichen mit der Referenz-Polynucleotid- bzw. -Polypeptidsequenz.
  • Der Identitätsprozentsatz wird nach optimaler vergleichender Anordnung ("alignment") von zwei Polynucleotiden oder Polypeptidsequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei die Anteile der Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen von einem oder mehreren Resten umfassen können, um die vergleichende Anordnung der Sequenzen zu optimieren. Das Vergleichsfenster enthält eine bestimmte Anzahl von Positionen (entweder einen Rest oder eine Lücke, entsprechend einer Insertion/Deletion eines Restes), wobei diese Anzahl von Positionen der Fenstergröße entspricht. Jede Fensterposition kann eine der folgende Situationen darstellen:
    • 1°/ Es gibt einen Rest (Nucleotid oder Aminosäure) an dieser Position auf der ersten vergleichend angeordneten Sequenz und einen davon verschiedenen Rest an der gleichen Position auf der zweiten vergleichend angeordneten Sequenz; in anderen Worten, die zweite Sequenz hat einen substituierten Rest an dieser Position, verglichen mit der ersten Sequenz.
    • 2°/ Es gibt einen Rest (Nucleotid oder Aminosäure) an dieser Position auf der ersten vergleichend angeordneten Sequenz und den gleichen Rest an der gleichen Position auf der zweiten vergleichend angeordneten Sequenz.
    • 3°/ Es gibt einen Rest (Nucleotid oder Aminosäure) an dieser Position auf der ersten vergleichend angeordneten Sequenz und keinen Rest an der gleichen Position auf der zweiten vergleichend angeordneten Sequenz; in anderen Worten, die zweite Sequenz weist eine Deletion an dieser Stelle auf, verglichen mit der ersten Sequenz.
  • Die Anzahl von Positionen innerhalb des Vergleichsfensters, die zu der ersten oben definierten Kategorie gehört, wird R1 genannt.
  • Die Anzahl an Positionen innerhalb des Vergleichsfensters, die zu der zweiten oben definierten Kategorie gehört, wird R2 genannt.
  • Die Anzahl von Positionen innerhalb des Vergleichsfensters, die zu der dritten oben definierten Kategorie gehört, wird R3 genannt.
  • Der Identitätsprozentsatz (%id) wird bzw. kann mittels einer der folgenden Formeln berechnet werden: %id = R2/(R1 + R2 + R3) × 100,oder %id = (R2 + R3)/(R1 + R2 + R3) × 100
  • Die vergleichende Anordnung von Sequenzen zu Vergleichszwecken kann unter Verwendung eines Beliebigen einer Vielfalt von Sequenzvergleichsalgorithmen und -programmen, die im Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Derartige Algorithmen und Programme schließen Folgendes ein, sind aber keineswegs darauf beschränkt:TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, FASTDB, WUBLAST, Gapped-BLAST, PSI-BLAST (Pearson und Lipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444–2448; Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol., 215: 403–410; Altschul et al., (1993), Nature hGHtics 3: 266–272; Altschul et al., (1997), Nuc. Acids Res., 25: 3389–3402; Thompson et al., (1994), Nuc. Acids Res., 22: 4673–4680; Higgins et al., (1996), Meth. Enzymol., 266: 383–402; Brutlag et al., (1990), Corp. App. Biosci., 6: 237–245; Jones und Swindells, (2002), Trends Biochem Sci, 27: 161–4; Olsen et al., (1999), Pac Symp Biocomput; 302–13), wobei die Offenbarungen davon durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind.
  • In einer speziellen Ausführungsform wird das Smith-Waterman-Verfahren mit einer Punktzahl-Matrix bzw. Substitutionsmatrix ("scoring matrix"), wie PAM, PAM 250 oder vorzugsweise mit BLOSUM-Matrizen, wie BLOSUM60 oder BLOSUM62, und mit voreingestellten Parameter (Lückeneinführungsstrafe („Gap Opening Penalty") = 10 und Lückenerweiterungsstrafe ("Gap Extension Penalty") = 1) oder mit vom Anwender spezifizierten Parameter, die vorzugsweise den voreingestellten Parameter überlegen sind, verwendet.
  • In einer anderen speziellen Ausführungsform werden Protein- und Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST")-Programme mit den voreingestellten Parameter oder mit modifizierten Parametern, bereitgestellt durch den Anwender, vergleichend angeordnet. Vorzugsweise ist die verwendete Substitutionsmatrix die BLOSUM62-Matrix (Gonnet et al., (1992), Science, 256: 1443–1445; Henikoff und Henikoff, (1993), Proteins, 17: 49–61, wobei diese Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten eingeschlossen sind). Weniger bevorzugt können auch die PAM- oder PAM250-Matrizen verwendet werden (siehe z.B. Schwartz und Dayhoff, (1978), Hrsg., Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation, wobei diese Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist).
  • In noch einer anderen speziellen Ausführungsform werden die Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen unter Verwendung des FASTDB-Computerprogrammes, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al., (1990), supra, basiert, vergleichend angeordnet. Bevorzugte Parameter, die in einer vergleichenden Anordnung von DNA-Sequenzen mit FASTDB verwendet werden, sind:
    Matrix = Unitär bzw. Unitary, k-tuple = 4, Strafe bei Nichtübereinstimmung ("Mismatch Penalty") = 1, Verbindungsstrafe ("Joining Penalty") = 30, Randomisierungsgruppenlänge = 0, Ausschluss-Punktzahl ("Cutoff Score") = 1, Lückenstrafe ("Gap Penalty") = 5, Lückengrößenstrafe ("Gap Size Penalty") 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der betreffenden Nucleotidsequenz, was immer kürzer ist. Bevorzugte Parameter, die in einer vergleichenden Anordnung von Aminosäuren mit FASTDB verwendet werden, sind: Matrix = PAM 0, k-tuple = 2, Strafe bei Nichtübereinstimmung ("Mismatch Penalty") = 1, Verbindungsstrafe ("Joining Penalty") 20, Randomisierungsgruppenlänge = 0, Ausschluss-Punktzahl ("Cutoff Score") = 1, Fenstergröße = Sequenzlänge, Lückenstrafe ("Gap Penalty") = 5, Lückengrößenstrafe ("Gap Size Penalty") = 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der betreffenden Aminosäuresequenz, was immer kürzer ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Poly(ethylenglykol) kovalent durch Aminosäurereste von hGH oder Agonistenvarianten davon gebunden. Eine Vielfalt von aktivierten Poly(ethylenglykol)en mit einer Anzahl verschiedener funktioneller Gruppen, Linker, Konfigurationen und Molekulargewichten sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, die verwendet werden können, um PEG-hGH-Konjugate oder PEG-hGH-Agonistenvarianten-Konjugate zu erzeugen (für Übersichten siehe Roberts, M. J. et al., Adv. Drug Del. Rev., 54: 459–476, 2002, Harris, J. M. et al., Drug Delivery Systems, 40: 538–551, 2001). Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren der Verwendung von Aldehydchemie, um die Selektivität der PEG-Gruppierung gegenüber dem N-Terminus unter Verwendung einer Butyrylaldehyd-Linker-Gruppierung zu steuern. Der Butyrylaldehyd-Linker resultiert in erhöhter N-terminaler Spezifität, verglichen mit dem Acetaldehyd-Linker (Tabelle 1 und 1).
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugat mit der Struktur der Formel I oder Formel II
    Figure 00200001
    Formel I oder mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R Formel IIworin
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist;
    m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist;
    R humanes Wachstumshormon, Methionyl-Wachstumshormon oder eine humanes Wachstumshormon-Variante ist.
  • In einer speziellen Ausführungsform ist n zwischen 1 und 5 und m ist zwischen 1 und 5.
  • In einer speziellen Ausführungsform der Formel I ist n 1 und m ist 1; ist n 1 und m ist 2; ist n 1 und m ist 3; ist n 1 und m ist 4; ist n 1 und m ist 5; ist n 1 und m ist 6; ist n 1 und m ist 7; ist n 1 und m ist 8; ist n 1 und m ist 9; ist n 1 und m ist 10; ist n 2 und m ist 1; ist n 2 und m ist 2; ist n 2 und m ist 3; ist n 2 und m ist 4; ist n 2 und m ist 5; ist n 2 und m ist 6; ist n 2 und m ist 7; ist n 2 und m ist 8; ist n 2 und m ist 9; ist n 2 und m ist 10; ist n 3 und m ist 1; ist n 3 und m ist 2; ist n 3 und m ist 3; ist n 3 und m ist 4; ist n 3 und m ist 5; ist n 3 und m ist 6; ist n 3 und m ist 7; ist n 3 und m ist 8; ist n 3 und m ist 9; ist n 3 und m ist 10; ist n 4 und m ist 1; ist n 4 und m ist 2; ist n 4 und m ist 3; ist n 4 und m ist 4; ist n 4 und m ist 5; ist n 4 und m ist 6; ist n 4 und m ist 7; ist n 4 und m ist 8; ist n 4 und m ist 9; ist n 4 und m ist 10; ist n 5 und m ist 1; ist n 5 und m ist 2; ist n 5 und m ist 3; ist n 5 und m ist 4; ist n 5 und m ist 5; ist n 5 und m ist 6; ist n 5 und m ist 7; ist n 5 und m ist 8; ist n 5 und m ist 9; ist n 5 und m ist 10; ist n 6 und m ist 1; ist n 6 und m ist 2; ist n 6 und m ist 3; ist n 6 und m ist 4; ist n 6 und m ist 5; ist n 6 und m ist 6; ist n 6 und m ist 7; ist n 6 und m ist 8; ist n 6 und m ist 9; ist n 7 und m ist 10; ist n 7 und m ist 1; ist n 7 und m ist 2; ist n 7 und m ist 3; ist n 7 und m ist 4; ist n 7 und m ist 5; ist n 7 und m ist 6; ist n 7 und m ist 7; ist n 7 und m ist 8; ist n 7 und m ist 9; ist n 7 und m ist 10; ist n 8 und m ist 1; ist n 8 und m ist 2; ist n 8 und m ist 3; ist n 8 und m ist 4; ist n 8 und m ist 5; ist n 8 und m ist 6; ist n 8 und m ist 7; ist n 8 und m ist 8; ist n 8 und m ist 9; ist n 8 und m ist 10; ist n 9 und m ist 1; ist n 9 und m ist 2; ist n 9 und m ist 3; ist n 9 und m ist 4; ist n 9 und m ist 5; ist n 9 und m ist 6; ist n 9 und m ist 7; ist n 9 und m ist 8; ist n 9 und m ist 9; ist n 9 und m ist 10; ist n 10 und m ist 1; ist n 10 und m ist 2; ist n 10 und m ist 3; ist n 10 und m ist 4; ist n 10 und m ist 5; ist n 10 und m ist 6; ist n 10 und m ist 7; ist n 10 und m ist 8; ist n 10 und m ist 9; ist n 10 und m ist 10.
  • Eine spezielle Ausführungsform ist ein humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugat mit der Struktur:
    Figure 00210001
    oder mPEG-O(CH2CH2O)4CH2CH2CH2CH2-NH-R worin R humanes Wachstumshormon, Methionyl-Human-Wachstumshormon oder eine humanes Wachstumshormon-Variante ist.
  • Eine andere spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugat, in welchem das humane Wachstumshormon die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst oder daraus besteht.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugat, in welchem mehr als 80%, stärker bevorzugt 81%, stärker bevorzugt 82%, stärker bevorzugt 83%, stärker bevorzugt 84%, stärker bevorzugt 85%, stärker bevorzugt 86%, stärker bevorzugt 87%, stärker bevorzugt 88%, stärker bevorzugt 89%, stärker bevorzugt 90%, stärker bevorzugt 91%, stärker bevorzugt 92%, stärker bevorzugt 93%, stärker bevorzugt 94%, stärker bevorzugt 95%, stärker bevorzugt 96%, stärker bevorzugt 97 und stärker bevorzugt 98%, des Polyethylenglykols mit dem aminoterminalen Phenylalanin der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 konjugiert sind.
  • Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugates, in welchem mehr als 90% des Polyethylenglykols mit dem aminoterminalen Phenylalanin der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 konjugiert sind.
  • Eine andere spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugates, in welchem mehr als 95% des Polyethylenglykols mit dem aminoterminalen Phenylalanin der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 konjugiert sind.
  • Das Poly(ethylenglykol), das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht auf irgendeine spezielle Form oder irgendeinen speziellen Molekulargewichtsbereich be schränkt. Das Molekulargewicht des Poly(ethylenglykol)s kann zwischen etwa 500 und etwa 100.000 Dalton liegen. Der Begriff "etwa" gibt an, dass in Präparationen von Polyethylenglykol einige Moleküle mehr wiegen werden, einige weniger, als das angegebene Molekulargewicht, und das angegebene Molekulargewicht bezieht sich auf das mittlere Molekulargewicht. Es wird verstanden, dass in Verbindung mit Polymeren, wie Poly(ethylenglykol), ein bestimmtes Maß an Polydispersität besteht. Es ist bevorzugt, PEGs mit geringer Polydispersität zu verwenden. Normalerweise wird ein PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 500 bis etwa 60.000 verwendet. Ein spezieller PEG-Molekulargewichtsbereich der vorliegenden Erfindung ist von etwa 1.000 bis etwa 40.000. In einer anderen speziellen Ausführungsform ist das PEG-Molekulargewicht größer als etwa 5.000 bis etwa 40.000. In einer anderen speziellen Ausführungsform ist das PEG-Molekulargewicht etwa 20.000 bis etwa 40.000. Andere Größen können in Abhängigkeit von dem gewünschten therapeutischen Profil (z.B. Dauer der verzögerten bzw. verlängerten Freisetzung ("sustained release"), die gewünscht wird, der Wirkungen, falls vorhanden, auf die biologische Aktivität, dem Maß an oder Fehlen von Antigenität und anderen bekannten Wirkungen von Polyethylen auf ein therapeutisches Protein) verwendet werden. Z.B. kann das Polyethylenglykol ein mittleres Molekulargewicht von etwa 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 oder 100.000 Dalton haben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Poly(ethylenglykol) ein verzweigtes PEG mit mehr als einer gebundenen PEG-Gruppierung (siehe US 5 932 462 , US 5 342 940 , US 5 643 575 , US 5 919 455 , US 6 113 904 , US 5 183 660 , Kodera, Y., Bioconjugate Chemistry, 5: 283–288 (1994), und WO 02/09766 . In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Molekulargewicht jedes Poly(ethylenglykols) des verzweigten PEGs etwa 5.000–20.000. In einer speziellen Ausführungsform ist das Molekulargewicht jedes Poly(ethylenglykols) des verzweigten PEGs etwa 20.000.
  • Poly(alkylenoxid)e, namentlich Poly(ethylenglykol)e, werden über eine terminale reaktive Gruppe, welche eine Verknüpfungsgruppierung (Zwischenstück bzw. Spacer) zwischen dem PEG und dem Protein zurücklassen kann oder nicht, an hGH oder eine Agonistenvariante davon gebunden. Um die hGH-Konjugate oder Agonistenvarianten davon der vorliegenden Erfindung zu bilden, werden Polymere, wie Poly(alkylenoxid), inaktivierte Formen, wie der Begriff den Fachleuten mit gewöhnlichem Kenntnisstand in dem Fachgebiet bekannt ist, umgewandelt. Die reaktive Gruppe ist z.B. eine terminale reaktive Gruppe, welche eine Verbindung zwischen chemischen Gruppierungen auf dem Protein und Poly(ethylenglykol) vermittelt. Typischerweise werden eine oder beide der terminalen Hydroxylendgruppen des Polymers (d.h., die alpha- und Omega-terminalen Hydroxylgruppen) in reaktive funktionelle Gruppen umgewandelt, die eine kovalente Konjugation ermöglichen. Dieser Prozess wird häufig als "Aktivierung" bezeichnet, und das Poly(ethylenglykol)-Produkt mit der reaktiven Gruppe wird hierin nachstehend als "ein aktiviertes Poly(ethylenglykol)" bezeichnet. In einer speziellen Ausführungsform wird eine der terminalen Hydroxylendgruppen des Polymers umgewandelt oder mit einer nicht-reaktiven Gruppe versehen ("capped"). In einer speziellen Ausführungsform wird eine der terminalen Hydroxylendgruppen des Polymers umgewandelt oder mit einer Methylgruppe versehen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "mPEG" auf ein PEG, welches an einem Ende mit einer Methylgruppe versehen ist. Das mPEG kann strukturell als CH3O-(CH2CH2O)n-H dargestellt werden.
  • Polymere, die sowohl α- als auch ε-Verknüpfungsgruppen enthalten, werden als "bis-aktivierte Poly(alkylenoxide)" bezeichnet, und sie werden als "bifunktionell" bezeichnet. Polymere, welche die gleiche reaktive Gruppe an den α- und ε-terminalen Hydroxylen enthalten, werden manchmal als "homobifunktionell" oder "homobis-aktiviert" bezeichnet. Polymere, welche verschiedene reaktive Gruppen an den α- und ε-terminalen Hydroxylen enthalten, werden manchmal als "heterobifunktionell" (siehe z.B. WO 01/26692 ) oder "heterobis-aktiviert" bezeichnet. Polymere, welche eine einzelne reaktive Gruppe enthalten, werden als "monoaktivierte" Polyalkylenoxide oder "monofunktionell" bezeichnet. Andere, im Wesentlichen nicht-antigene Polymere werden in gleicher bzw. ähnlicher Weise "aktiviert" oder "funktionalisiert".
  • Die aktivierten Polymere sind somit zum Vermitteln einer Bindung zwischen chemischen Gruppierungen auf dem Protein, wie α- oder ε-Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen, und Poly(ethylenglykol) geeignet. Bis-aktivierte Polymere können in dieser Weise mit zwei Proteinmolekülen oder einem Proteinmolekül und einem reaktiven kleinen Molekül in einer anderen Ausführungsform reagieren, um effektiv Proteinpolymere oder Konjugate aus Protein und kleinem Molekül über Querverknüpfungen zu bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden sekundäre Amin- oder Amidverknüpfungen unter Verwendung der N-terminalen α-Aminogruppe oder von ε-Aminogruppen von Lysin von hGH oder einer Agonistenvariante davon und dem aktivierten PEG gebildet. In einem anderen bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine sekundäre Aminverknüpfung zwischen der N-terminalen primären α- oder einer ε-Aminogruppe von hGH oder einer Agonistenvariante davon und einzel- oder verzweigtkettigem PEG-Aldehyd mittels reduktiver Alkylierung mit einem geeigneten Reduktionsmittel, wie NaCNBH3, NaBH3, Pyridin-Boran etc., wie beschrieben in Chamow et al., Bioconjugate Chem., 5: 133–140 (1994), US-Patent Nr. 4 002 531 , WO 90/05534 und US-Patent Nr. 5 824 784 , gebildet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 81%, vorzugsweise mindestens 82%, vorzugsweise mindestens 83%, vorzugsweise mindestens 84%, vorzugsweise mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 86%, vorzugsweise mindestens 87%, vorzugsweise mindestens 88%, vorzugsweise mindestens 89%, vorzugsweise mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 91%, vorzugsweise mindestens 92%, vorzugsweise mindestens 93%, vorzugsweise mindestens 94%, vorzugsweise mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 96%, vorzugsweise mindestens 97% und am stärksten bevorzugt mindestens 98% des Poly(ethylenglykol)s auf der aminoterminalen α-Aminogruppe.
  • Konjugationsreaktionen, die als PEGylierungsreaktionen bezeichnet werden, wurden historisch in Lösung mit einem molaren Überschuss an Polymer und ohne Rücksicht darauf, wo das Polymer an das Protein binden würde, durchgeführt. Derartige allgemeine Techniken erwiesen sich jedoch typischerweise als inadäquat zum Konjugieren bioaktiver Proteine an nicht-antigene Polymere, während ausreichende Bioaktivität beibehalten wird. Ein Weg, um die Bioaktivität des hGH oder der Agonistenvariante davon aufrecht zu erhalten, ist es, in dem Polymerkupplungsprozess im Wesentlichen die Konjugation derjenigen reaktiven Gruppen von hGH oder einer Agonistenvariante davon, die mit der/den Rezeptorbindungsstelle/n assoziiert sind, zu vermeiden. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Anmeldung ist es, einen Prozess des Konjugierens von Poly(ethylenglykol) an hGH oder eine Agonistenvariante davon bereitzustellen, wobei hohe Level an beibehaltener Aktivität aufrecht erhalten werden.
  • Die chemische Modifizierung durch eine kovalente Bindung kann unter jeglichen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die gewöhnlich in einer Reaktion einer biologisch aktiven Substanz mit dem aktivierten Poly(ethylenglykol) eingesetzt werden. Die Konjugationsreaktion wird unter relativ milden Bedingungen durchgeführt, um das Inaktivieren des hGH oder der Agonistenvariante davon zu vermeiden. Milde Bedingungen schließen das Aufrechterhalten des pHs der Reaktionslösung in dem Bereich von 3 bis 10 und der Reaktionstemperatur innerhalb des Bereichs von etwa 0°–37°C ein. In den Fällen, in denen die reaktiven Aminosäurereste in hGH oder einer Agonistenvariante davon freie Aminogruppen aufweisen, wird die obige Modifizierung vorzugsweise in einer nicht-einschränkenden Liste geeigneter Puffer (pH 3–10), einschließlich Phosphat, MES, Citrat, Acetat, Succinat oder HEPES, für 1–48 Stunden bei 4°–37°C durchgeführt. Beim Abzielen ("targeting") auf die N-terminalen Aminogruppen mit Reagenzien, wie PEG-Aldehyden, wird vorzugsweise pH 4–7 aufrecht erhalten. Das aktivierte Poly(ethylenglykol) kann in dem 0,01- bis 100-Fachen, vorzugsweise dem etwa 0,01- bis 2,5-Fachen, der molaren Menge der Anzahl freier Aminogruppen des hGH oder der Agonistenvariante davon verwendet werden. Wenn die reaktiven Aminosäurereste in hGH oder einer Agonistenvariante davon andererseits freie Carboxylgruppen aufweisen, wird die obige Modifizierung vorzugsweise bei einem pH von etwa 3,5 bis etwa 5,5 durchgeführt; z.B. wird die Modifizierung mit Poly(oxyethylendiamin) in Gegenwart von Carbodiimid (pH 4–5) für 1–24 Stunden bei 4°–37°C durchgeführt. Das aktivierte Poly(ethylenglykol) kann in dem 0,01- bis 300-Fachen der molaren Menge der Anzahl freier Carboxylgruppen von hGH oder einer Agonistenvariante davon verwendet werden.
  • In separaten Ausführungsformen überschreitet die Obergrenze für die Menge an Polymer, die in die Konjugationsreaktionen eingeschlossen ist, etwa 1:1 bis zu dem Maß, bis zu dem es möglich ist, das aktivierte Polymer und hGH oder eine Agonistenvariante davon umzusetzen, ohne dass sich eine wesentliche Menge von Spezies mit hohem Molekulargewicht bildet, d.h., mehr als etwa 20% der Konjugate enthalten mehr als etwa einen Polymerstrang pro Molekül hGH oder Agonistenvariante davon. Z.B. wird in diesem Aspekt der Erfindung in Erwägung gezogen, dass Verhältnisse von bis zu etwa 6:1 eingesetzt werden können, um signifikante Mengen der gewünschten Konjugate zu bilden, die anschließend von jeglichen Spezies mit hohem Molekulargewicht isoliert werden können.
  • In einem anderen Aspekt dieser Anmeldung können bifunktionell aktivierte PEG-Derivate verwendet werden, um polymere hGH-PEG-Moleküle oder derartige Moleküle der Agonistenvariante davon zu erzeugen, in welchen mehrere hGH-Moleküle oder Moleküle der Agonistenvariante davon über PEG quervernetzt sind. Obwohl die hierin beschriebenen Reaktionsbedingungen in signifikanten Mengen von nicht-modifiziertem hGH oder der Agonistenvariante davon resultieren können, kann das nicht-modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon leicht in zukünftige Chargen für zusätzliche Konjugationsreaktionen zurückgeführt werden. Die Verfahren der vorliegenden Anmeldung erzeugen überraschenderweise sehr wenig, d.h., weniger als etwa 30%, und stärker bevorzugt weniger als etwa 10%, an Spezies mit hohem Molekulargewicht und Spezies, die mehr als einen Polymerstrang pro hGH oder Agonistenvariante davon enthalten. Die Reaktionsbedingungen sollen jenen gegenüberstellt werden, die typischerweise für Polymerkonjugationsreaktionen verwendet werden, in denen das aktivierte Polymer in mehrfachem molaren Überschuss bezüglich des Ziels vorhanden ist. In anderen Aspekten der Anmeldung ist das Polymer in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 50 Äquivalenten pro Äquivalent hGH oder Agonistenvariante davon vorhanden. In anderen Aspekten der Anmeldung ist das Polymer in Mengen von etwa 1 bis etwa 10 Äquivalenten pro Äquivalent hGH oder Agonistenvariante davon vorhanden.
  • Die Konjugationsreaktionen der vorliegenden Anmeldung stellen anfänglich ein Reaktionsgemisch oder einen Pool bereit, der Mono- und Di-PEG-hGH-Konjugate, nicht-reagiertes hGH, nicht-reagiertes Polymer und gewöhnlich weniger als etwa 20% Spezies mit hohem Molekulargewicht enthält. Die Spezies mit hohem Molekulargewicht schließen Konjugate ein, die mehr als einen Polymerstrang und/oder polymerisierte PEG-hGH-Spezies oder derartige Spezies der Agonistenvariante davon enthalten. Nachdem die nicht-reagierten Spezies und die Spezies mit hohem Molekulargewicht entfernt wurden, werden Zusammensetzungen gewonnen, die primär Mono- und Di-Polymer-hGH-Konjugate oder derartige Konjugate der Agonistenvariante davon enthalten. Angesichts der Tatsache, dass die Konjugate meistenteils einen einzelnen Polymerstrang einschließen, sind die Konjugate im Wesentlichen homogen. Dieses modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon hat mindestens etwa 0,1% der biologischen Aktivität in vitro, die mit dem nativen oder nicht-modifizierten hGH oder der Agonistenvariante davon assoziiert ist, wie unter Verwendung des Standard-FDC-P1-Zellproliferationsassays (Clark et al., Journal of Biological Chemistry, 271: 21969–21977, 1996), eines Rezeptorbindungsassays ( US 5 057 417 ) oder des Wachstums bei Ratten mit Hypophysektomie (Clark et al., Journal of Biological Chemistry, 271: 21969–21977, 1996) gemessen. In bevorzugten Aspekten der Anmeldung hat das modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon jedoch etwa 25% der biologischen Aktivität in vitro, stärker bevorzugt hat das modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon etwa 50% der biologischen Aktivität in vitro, stärker bevorzugt hat das modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon etwa 75% der biologischen Aktivität in vitro, und am stärksten bevorzugt hat das modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon äquivalente oder verbesserte biologische Aktivität in vitro.
  • Die Prozesse der vorliegenden Anmeldung schließen vorzugsweise eher begrenzte Verhältnisse von Polymer zu hGH oder Agonistenvariante davon ein. Somit wurde festgestellt, dass die hGH-Konjugate oder die Konjugate einer Agonistenvariante davon vorherrschend auf Spezies begrenzt sind, die nur einen Polymerstrang enthalten. Darüber hinaus ist die Anfügung bzw. Bindung des Polymers an die reaktiven Gruppen des hGH oder der Agonistenvariante davon im Wesentlichen weniger zufällig, als wenn höhere molare Überschüsse des Polymerlinkers verwendet werden. Das nicht-modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon, welche in dem Reaktionspool vorhanden sind, nachdem die Konjugationsreaktion gequencht wurde, kann in zukünftige Reaktionen unter Verwendung von Ionenaustauscher- oder Größenausschlusschromatographie oder ähnlichen Trenntechniken zurückgeführt werden.
  • Ein Poly(ethylenglykol)-modifiziertes hGH oder eine Agonistenvariante davon, nämlich chemisch modifiziertes Protein gemäß der vorliegenden Anmeldung, kann aus einem Reaktionsgemisch mittels konventioneller Verfahren, welche zur Reinigung von Proteinen verwendet werden, wie Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauscherchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Gelchromatographie und Elektrophorese, aufgereinigt werden. Ionenaustauscherchromatographie ist besonders wirksam beim Entfernen von nicht-reagiertem Poly(ethylenglykol) und hGH oder der Agonistenvariante davon. In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung werden die Mono- und Di-Polymer-hGH-Spezies oder derartige Spezies der Agonistenvariante davon aus dem Reaktionsgemisch isoliert, um Spezies mit hohem Molekulargewicht und nicht-modifiziertes hGH oder die Agonistenvariante davon zu entfernen. Die Abtrennung wird durch Platzieren der gemischten Spezies in einer Pufferlösung, die von etwa 0,5 bis 10 mg/ml der hGH-Polymer-Konjugate oder derartiger Konjugate der Agonistenvariante davon enthält, herbeigeführt. Geeignete Lösungen haben einen pH von etwa 4 bis etwa 10. Die Lösungen enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Puffersalze, ausgewählt aus KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H und NaOH.
  • In Abhängigkeit von dem Reaktionspuffer kann es sein, dass die hGH-Polymer-Konjugat-Lösung oder die entsprechende Lösung mit der Agonistenvariante davon zuerst eine/n Pufferaustausch/Ultrafiltration durchlaufen muss, um jegliches nicht-reagierte Polymer zu ent fernen. Z.B. kann die PEG-hGH-Konjugat-Lösung oder die entsprechende Lösung mit der Agonistenvariante davon durch eine Membran mit einem niedrigen Molekulargewichtsausschluss (10.000 bis 30.000 Dalton) ultrafiltriert werden, um die meisten unerwünschten Materialien, wie nicht-reagiertes Polymer, Tenside, falls vorhanden, oder dergleichen zu entfernen.
  • Die Fraktionierung der Konjugate in einen Pool, der die gewünschten Spezies enthält, wird vorzugsweise unter Verwendung eines Ionenaustauscherchromatographie-Mediums durchgeführt. Derartige Medien sind befähigt, selektiv PEG-hGH-Konjugate oder die entsprechenden Konjugate der Agonistenvariante davon über Unterschiede in der Ladung zu binden, welche in einer etwas vorhersagbaren Weise variiert. Z.B. wird die Oberflächenladung von hGH oder einer Agonistenvariante davon durch die Anzahl verfügbarer geladener Gruppen auf der Oberfläche des Proteins bestimmt. Diese geladenen Gruppen dienen typischerweise als Punkt einer potentiellen Anfügung bzw. Bindung von Poly(alkylenoxid)-Polymeren. Daher werden hGH-Konjugate oder entsprechende Konjugate der Agonistenvariante davon eine von den anderen Spezies verschiedene Ladung aufweisen, um eine selektive Isolierung zu ermöglichen.
  • Stark polare Anionen- oder Kationenaustauscherharze, wie quaternäres Amin- bzw. Sulfopropylharze, werden für das Verfahren der vorliegenden Anmeldung verwendet. Ionenaustauscherharze werden besonders bevorzugt. Eine nicht-einschränkende Liste der eingeschlossenen kommerziell verfügbaren Kationenaustauscherharze, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind SP-Hitrap®, SP Sepharose HP® und SP Sepharose® Fast Flow. Andere geeignete Kationenaustauscherharze, z.B. S- und CM-Harze, können ebenfalls verwendet werden. Eine nicht-einschränkende Liste von Anionenaustauscherharzen, einschließlich kommerziell verfügbarer Anionenaustauscherharze, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Q-Hitrap®, Q Sepharose HP® und Q Sepharose® Fast Flow. Andere geeignete Anionenaustauscherharze, z.B. DEAE-Harze, können ebenfalls verwendet werden.
  • Z.B. wird das Anionen- oder Kationenaustauscherharz vorzugsweise in eine Säule gepackt und mittels konventioneller Mittel equilibriert. Ein Puffer mit dem gleichen pH und der gleichen Osmolalität wie bei der Lösung des Polymer-konjugierten hGHs oder der Agonistenvariante davon wird verwendet. Der Elutionspuffer enthält vorzugsweise ein oder mehrere Salze, ausgewählt aus KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 und (NH4)2CO3. Die Konjugat-enthaltende Lösung wird dann auf der Säule adsorbiert, wobei das nicht-reagierte Polymer und einige Spezies mit hohem Molekulargewicht nicht zurückgehalten werden. Mit Beendigung der Aufgabe wird ein Gradientenfluss eines Elutionspuffers mit zunehmenden Salzkonzentrationen auf die Säule angewendet, um die gewünschte Fraktion von Polyalkylenoxid-konjugiertem hGH oder der Agonistenvariante davon zu eluieren. Die eluierten vereinigten Fraktionen werden vorzugsweise auf einheitliche Polymer-Konjugate nach dem Kationen- oder Anionenaustauscher-Trennungsschritt beschränkt. Jegliche nicht-konjugiertes hGH-Spezies oder entsprechende Spezies der Agonistenvariante davon können dann mittels konventioneller Techniken aus der Säule zurückgewaschen werden. Falls gewünscht, können Mono- und Mehrfach-PEGylierte hGH-Spezies oder entsprechende Spezies der Agonistenvariante davon weiter über zusätzliche Ionenaustauscherchromatographie oder Größenausschlusschromatographie voneinander getrennt werden.
  • Techniken, die mehrere isokratische Stufen von zunehmender Salzkonzentration oder zunehmendem pH einsetzen, können ebenfalls verwendet werden. Mehrere isokratische Elutionsstufen von zunehmender Konzentration werden in der aufeinanderfolgenden Elution von Di- und dann Mono-hGH-Polymer-Konjugaten oder den entsprechenden Konjugaten der Agonistenvariante davon eluieren.
  • Der Temperaturbereich für die Elution ist zwischen etwa 4°C und etwa 25°C. Vorzugsweise wird die Elution bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 22°C durchgeführt. Z.B. wird die Elution der PEG-hGH-Fraktion oder der entsprechenden Fraktion mit der Agonistenvariante davon mittels UV-Absorption bei 280 nm detektiert. Das Sammeln der Fraktionen kann durch einfache Zeitelutionsprofile erreicht werden.
  • Ein Tensid kann in den Prozessen des Konjugierens des Poly(ethylenglykol)-Polymers mit der hGH-Gruppierung oder der Agonistenvariante davon verwendet werden. Geeignete Tenside schließen Mittel vom ionischen Typ, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), ein. Andere ionische Tenside, wie Lithiumdodecylsulfat, quaternäre Ammoniumverbindungen, Taurocholinsäure, Caprylsäure, Decansulfonsäure etc., können ebenfalls verwendet werden. Nicht-ionische Tenside können ebenfalls verwendet werden. Z.B. können Materialien, wie Poly(oxyethylen)sorbitane (Tweens), Poly(oxyethylen)ether (Tritone), verwendet werden. Siehe auch Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992), Calbiochem Corp. Die einzigen Beschränkungen bei den Tensiden, die in den hierin beschriebenen Prozessen verwendet werden, sind, dass sie unter Bedingungen und bei Konzentrationen verwendet werden, die keine wesentliche irreversible Denaturierung von hGH oder der Agonistenvariante davon verursachen, und die die Polymerkonjugation nicht vollständig inhibieren. Die Tenside sind in den Reaktionsgemischen in Mengen von etwa 0,01- bis 0,5%, vorzugsweise von 0,05–0,5% und am stärksten bevorzugt von etwa 0,075–0,25%, vorhanden. Gemische der Tenside werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
  • Es wird davon ausgegangen, dass die Tenside ein temporäres, reversibles Schutzsystem während des Polymerkonjugationsprozesses bereitstellen. Die Tenside zeigten sich wirksam dabei, der Polymerkonjugation selektiv entgegenzuwirken ("discouraging"), wohingegen sie das Voranschreiten der Lysin-basierten oder aminoterminal-basierten Konjugation zuließen.
  • Das vorliegende Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon weist eine länger andauernde pharmakologische Wirkung auf, die möglicherweise seiner verlängerten Halbwertszeit in vivo zugeschrieben werden kann.
  • Eine andere Ausführungsform der Anmeldung betrifft Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung oder Störung, bei der die Verwendung von GH, vorzugsweise hGH, vorteilhaft ist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Poly(ethylenglykol)-modifizierten hGHs oder einer Agonistenvariante davon, allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel, an einen Patienten, der dessen bedarf. Die vorliegende Erfindung betrifft speziell die Verwendung eines erfindungsgemäßen Poly(ethylenglykol)-modifizierten hGHs oder einer Agonistenvariante davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung oder Störung, bei der die Verwendung von GH, vorzugsweise hGH, vorteilhaft ist. Zusätzlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes Poly(ethylenglykol)-modifiziertes hGH oder eine Agonistenvariante davon zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung oder Störung, bei der die Verwendung von GH, vorzugsweise hGH, vorteilhaft ist.
  • Erkrankungen oder Störungen, bei denen die Verwendung von GH vorteilhaft ist, schließen, ohne Einschränkung darauf, Wachstumshormonmangel (GHD), Wachstumshormonmangel bei Erwachsenen (aGHD), Turner-Syndrom, Wachstumsstillstand bzw. Wachstumsrückstand bei Kinder, die für ihr Gestationsalter zu klein geboren wurden (SGA), Prader-Willi-Syndrom (PWS), chronische Niereninsuffizienz (CRI), Aids-Syndrom, Alter, Nierenversagen im Endstadium, cystische Fibrose, erektile Dysfunktion, HIV-Lipodystrophie, Fibromyalgie, Osteoporose, Gedächtnisstörungen, Depression, Morbus Crohn, Skelettdysplasien, traumatische Hirnverletzung, Subarachnoidalblutung, Noonan-Syndrom, Down-Syndrom, idiopathischen Kleinwuchs ("Idiopathic short stature") (ISS), Nierenerkrankung im Endstadium ("End stage renal disease") (ESRD), sehr geringes Geburtsgewicht ("Very low birth weight") (VLBW), Knochenmark-Stammzellgewinnung ("Bone marrow stem cell rescue"), metabolisches Syndrom, Glucocorticoidmyopathie, Kleinwuchs bei Kinder aufgrund von Glucocorticoid-Behandlung und Wachstumsrückstand ("Failure of growth"), der kleine Frühgeborene erfasst ("catching for short premature children"), ein.
  • In einer spezielleren Ausführungsform der Erfindung wird das Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH der Anmeldung oder die Agonistenvariante davon in der Prävention und/oder Behandlung von Störungen oder Erkrankungen verwendet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus idopathischem Kleinwuchs, sehr geringem Geburtsgewicht, traumatischer Hirnverletzung, metabolischem Syndrom, Subarachnoidalblutung, Kleinwuchs bei Kindern aufgrund von Glucocorticoid-Behandlung, Wachstumsrückstand, der kleine Frühgeborene erfasst, und Noonan-Syndrom.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein erfindungsgemäßes Poly(ethylenglykol)-modifiziertes hGH oder eine Agonistenvariante davon, allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel, und mindestens ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens oder einen pharma zeutisch annehmbaren Träger. Das vorliegende Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH oder die Agonistenvariante davon kann dann in Pharmazeutika formuliert werden, die auch ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, ein Mittel zum Herstellen einer isotonischen Lösung, ein pH-Konditionierungsmittel und dergleichen enthalten, um sie an einen Patienten zu verabreichen.
  • Die obigen Pharmazeutika können subkutan, intramuskulär, intravenös, pulmonal, intradermal oder oral, in Abhängigkeit von dem Zweck der Behandlung, verabreicht werden. Eine Dosis kann auch auf der Art und dem Zustand der Störung eines Patienten, der behandelt werden soll, basieren, wobei sie normalerweise zwischen 0,1 mg und 5 mg pro Injektion und zwischen 0,1 mg und 50 mg bei einer oralen Verabreichung für einen Erwachsenen beträgt.
  • Wie hierin verwendet, kann das Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH oder die Agonistenvarianten davon der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel verwendet werden. Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe "Co-Verabreichung", "co-verabreicht" und "in Kombination mit", die sich auf die Verbindungen A und ein oder mehrere andere therapeutische Mittel beziehen, das Folgende bedeuten, sie beziehen sich auf das Folgende und schließen das Folgende ein:
    • – simultane Verabreichung einer derartigen Kombination aus A und therapeutischem/n Mittel/n an einen Patienten, der einer Behandlung bedarf, wenn derartige Komponenten zusammen in einer einzelnen Dosierungsform formuliert sind, welche die Komponenten zur im Wesentlichen gleichen Zeit an den Patienten freisetzt,
    • – im Wesentlichen simultane Verabreichung einer derartigen Kombination aus A und therapeutischem/n Mittel/n an einen Patienten, der einer Behandlung bedarf, wenn derartige Komponenten getrennt voneinander in separaten Dosierungsformen formuliert sind, welche durch den Patienten zur im Wesentlichen gleichen Zeit genommen werden, worauf die Komponenten zur im Wesentlichen gleichen Zeit an den Patienten freigesetzt werden,
    • – sequenzielle Verabreichung einer derartigen Kombination aus A und therapeutischem/n Mittel/n an einen Patienten, der einer Behandlung bedarf, wenn derartige Komponenten getrennt voneinander in separaten Dosierungsformen formuliert sind, welche durch den Patienten zu aufeinanderfolgenden Zeiten mit einem signifikanten Zeitintervall zwischen jeder Verabreichung genommen werden, worauf die Komponenten zu im Wesentlichen verschiedenen Zeiten an den Patienten freigesetzt werden, und
    • – sequenzielle Verabreichung einer derartigen Kombination aus A und therapeutischem/n Mittel/n an einen Patienten, der einer Behandlung bedarf, wenn derartige Komponenten zusammen in einer einzelnen Dosierungsform formuliert sind, welche die Komponenten in einer kontrollierten Weise freisetzt, worauf sie gleichzeitig, nacheinander und/oder überlappend zur gleichen und/oder zu verschiedenen Zeiten an den Patienten verabreicht werden.
  • Geeignete Beispiele anderer therapeutischer Mittel, welche in Kombination mit A verwendet werden können, ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze und/oder von ihnen stammende Formen schließen Folgendes ein, sind aber keineswegs darauf beschränkt: Aromataseinhibitoren, wie Exemestan, Formestan, Atamestan, Fadrozol, Letrozol, Vorozol und Anastrozol, Regulatoren für freie Fettsäuren, einschließlich Fibrinsäure-Derivate (wie Fenofibrat, Clofibrat, Gemfibrozil, Bezafibrat und Ciprofibrat) und Nicotinsäure-Derivate, wie Acipimox; Insulin-Sensitizer, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Biguanide, wie Metformin, PPAR-gamma-Insulin-Sensitizer ("PPAR gamma insulin sensitizing agents") und Thiazolidindione ("thiazolodeniones"), wie Troglitazon und Rosiglitazon; Troglitazon, 5-[[4-[3,4-Dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-]-benzopyran-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidindion V411 (DIABII, Glaucanin); Pioglitazon (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS), chemische Bezeichnung: 2,4-Thiazolidindion, 5-[[4-[2-(5-Ethyl-2-pyridinyl)ethoxy]phenyl]methyl]-, Monohydrochlorid, (a/–); Rosiglitazon (Avandia, BRL 49653, BRL 49653C), chemische Bezeichnung: 2,4-Thiazolidindion, 5-[[4-[2-(Methyl-2-pyridinylamino)ethoxy]phenyl]methyl]; 25 Bexaroten oral (LGD 1069 oral, Targretin oral, Targretin, Targretyn oral, Targrexin oral), chemische Bezeichnung: 4-[1-(3,5,5,8,8-Pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthyl)ethenyl]benzoesäure; ZD 2079 (ICI D 2079) (chemische Bezeichnung: (R)-N-[2-4-(Carboxymethyl)phenoxy]ethyl)-N-(2-hydroxy-2-phenethyl)-Ammoniumchlorid; Netoglitazon ("Isaglitazone", MCC 555, RWJ 241947) (chemische Bezeichnung: 5-[6-(2-Fluorbenzyloxy)naphthalin-2-ylmethyl]thiazolidin-2,4-dion); INS (D-Chiro-Inositol) (chemische Bezeichnung: D-1,2,3,4,5,6-Hexahydroxycyclohexan); ON 2344 (DRF 2593); Dexlipotam, chemische Bezeichnung: 5(R)-(1,2-Dithiolan-3-yl)pentansäure; HQL 975, chemische Bezeichnung: 3-[4-[2-(5-Methyl-2-phenyloxazol-4-yl)ethoxy]phenyl]-2(S)-(propylamino)propionsäure; YM 268, chemische Bezeichnung: 5,5'-Methylenbis(1,4-phenylen)bismethylenbis(thiazolidin-2,4-dion). PPAR-Agonisten in der Entwicklung schließen Folgendes ein: Reglitazar (JTT 501, PNU 182716, PNU 716) (chemische Bezeichnung: Isoxazolidien-3,5-dion, 4-[[4-(2-Phenyl-5-methyl)-1,3-oxazolyl]ethoxyphenyl-4]methyl-, (4RS)); I (RP 297, chemische Bezeichnung: 10 5-(2,4-Dioxothiazolidin-5-ylmethyl)-2-methoxy-N-[4-(trifluormethyl)benzylbenzamid; R 119702 (CI 1037, CS 011), chemische Bezeichnung: (/–)-5-[4-(5-Methoxy-1H-benzimidazol-2-ylmethoxy)benzyl]thiazolidin-2,4-dion, Hydrochlorid; 15 DRF 2189, chemische Bezeichnung: 5-[[4-[2-(1-Indolyl)ethoxy]phenyl]methyl]thiazolidin-2,4-dion; Cortisolsynthese-Inhibitoren, wie Ketoconazol, Econazol oder Miconazol; Wachstumshormone, wie Somatropin oder Somatonorm und ihre Derivate, wie humanes Wachstumshormon-Fusionsproteine, wie ALBUTROPIN; Polyethylenglykol-Wachstumshormone, wie das Cystein-PEGylierte Wachstumshormon BT 005 (Bolder BioTechnology Inc.); Wachstumshormon-Sekretagoga, wie z.B. SM 130686 (Sumitomo), "Capromorelin" (Pfizer), Mecasermin (Fujisawa), Sermorelin (Salk Institut, Bio-Technology General), Somatrem, Somatomedin (C Llorente; Pharmacia Corporation), Examorelin, "Tabimorelin"; CP 464709 (Pfizer), LY 426410 und LY 444711 (Lilly); 8-(Aminoalkoxyimino)-8H- dibenzo[a,e]triazolo[4,5-c]cycloheptene, wie offenbart in WO 2002057241 , 2-substituierte Dibenzo[a,e]-1,2,3-triazolo[4,5-c][7]annulen-8-one, wie beschrieben in WO2002056873 ; die Wachstumshormon-freisetzenden Peptide ("growth hormone releasing peptides") GHRP-6 und GHRP-1, wie beschrieben in US-Patent Nr. 4 411 890 und den Veröffentlichungen WO 89/07110 , WO 89/07111 , B-HT920, Hexarelin und GHRP-2, wie beschrieben in WO 93/04081 , oder Wachstumshormon-freisetzendes Hormon ("growth hormone releasing hormone") (GHRH, auch bezeichnet als GRF) und seine Analoga, Somatomedine, einschließlich IGF-1 und IGF-2 und ihre Derivate, wie SomatoKine – eine rekombinante Fusion des Insulin-artigen Wachstumsfaktors-1 und seines Bindungsproteins, BP-3, alpha-2-adrenerge Agonisten, wie Clonidin, Xylazin, Detomidin und Medetomidin, oder Serotonin-5HTID-Agonisten, wie Sumitriptan ("surnitriptan"), oder Mittel, welche Somatostatin oder seine Freisetzung inhibieren, wie Physostigmin und Pyridostigmin, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company); Dipeptid-Derivate, wie beschrieben in WO9858947 , Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV, wie Aminoacylpyrrolidinnitril, wie beschrieben in US 6 521 644 , WO 95/15309 und WO 98/19998 ; heterocyclische Beta-Aminodipeptidylpeptidase-Inhibitoren, wie jene, die in US20030100563 und WO2003082817 beschrieben sind; Wachstumshormon-freisetzende Verbindungen, wie beschrieben in US20030055261 , US20030040483 , EP 18 072 , EP 83 864 , WO 89/07110 , WO 89/01711 , WO 89/10933 , WO 88/9780 , WO 83/02272 , WO 91/18016 , WO 92/01711 , WO 93/04081 , WO 9514666 , EP0923539 , den US-Patenten mit den Nummern 5 206 235 , 5 283 241 , 5 284 841 , 5 310 737 , 5 317 017 , 5 374 721 , 5 430 144 , 5 434 261 , 5 438 136 , 5 494 919 , 5 494 920 , 5 492 916 , 5 536 716 und 5 578 593 , WO 94/13696 , WO 94/19367 , WO 95/03289 , WO 95/03290 , WO 95/09633 , WO 95/11029 , WO 95/12598 , WO 95/13069 , WO 95/14666 , WO 95/16675 , WO 95/16692 , WO 95/17422 , WO 95/17423 , WO 95/34311 und WO 96/02530 , Piperidine, Pyrrolidine und Hexahydro-1H-azepine, wie beschrieben in US 5 804 578 , US 5 783 582 , WO2004007468 , AMIDO-SPIROPIPERIDINE, wie jene, die in WO0104119 beschrieben sind, 2-Amino-5-pyrimidinessigsäure-Verbindungen, einschließlich 2-[(5,6-Dimethyl-2-benzoimidazolyl)amino]-4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimidinessigsäure (2) und 2-[(5,6-Dimethyl-2-benzoimidazolyl)amino]-4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimidinessigsäureethylester, wie beschrieben in US 6 329 383 , Benzimidazole, wie beschrieben in EP1155014 , analoge Peptidylverbindungen mit Bezug zu GRF und die Peptide aus US-Patent 4 411 890 , Antagonisten des Gonadotropin-freisetzenden Hormons, wie jene, die in WO0170228 , WO0170227 , WO0170228 , WO0069433 , WO0004013 , WO995156 , WO9951595 , WO9951231-4 , WO9941251-2 , WO9921557 , WO9921553 beschrieben sind, und 6-AZAINDOL-VERBINDUNGEN, wie beschrieben in WO0053602 , WO0053185 , WO0053181 , WO0053180 , WO0053179 , WO0053178 , US 6 288 078 ; IGF-1-Sekretagoga; Insulin-artiger Wachstumsfaktor-2 (IGF-2 oder Somatomedin A)- und IGF-2-Sekretagoga; Myostatin-Antagonisten und Verbindungen, welche die Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor-3 (FGFR-3)-Tyrosinkinase inhibieren.
  • Die eingeschlossenen Polymersubstanzen sind auch vorzugsweise bei Raumtemperatur wasserlöslich. Eine nicht-einschränkende Liste derartiger Polymere schließt Poly(alkylenoxid)-Homopolymere, wie Poly(ethylenglykol) oder Poly(propylenglykole), Poly(oxyethylenierte Polyole), Copolymere davon und Blockcopolymere davon ein, vorausgesetzt, dass die Wasserlöslichkeit der Blockcopolymere beibehalten bleibt.
  • Als eine Alternative zu PEG-basierten Polymeren können effektiv bzw. tatsächlich nicht-antigene Materialien, wie Dextran, Poly(vinylpyrrolidone), Poly(acrylamide), Poly(vinylalkohole), Kohlenhydrat-basierte Polymere und dergleichen verwendet werden. Tatsächlich kann die Aktivierung der α- und ε-terminalen Gruppen dieser polymeren Substanzen in Weisen bewirkt werden, die denjenigen ähnlich sind, die verwendet werden, um Poly(alkylenoxide) umzuwandeln, und sie werden somit den Fachleuten mit gewöhnlichem Kenntnisstand offensichtlich sein. Fachleute mit gewöhnlichem Kenntnisstand auf dem Fachgebiet werden erkennen, dass die vorausgehende Liste nur veranschaulichend ist, und dass alle Polymermaterialien, welche die hierin beschriebenen Eigenschaften aufweisen, in Erwägung gezogen werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "wirksam bzw. tatsächlich nicht-antigen" alle Materialien, die im Fachgebiet so verstanden werden, dass sie nicht-toxisch sind und dass sie keine merkliche immunogene Reaktion in Säugern auslösen.
  • Definitionen
  • Das Folgende ist eine Liste von Abkürzungen und den entsprechenden Bedeutungen, wie sie hierin austauschbar verwendet werden:
    • g
    Gramm
    mg
    Milligramm
    ml oder mL
    Milliliter
    RT
    Raumtemperatur
    PEG
    Poly(ethylenglykol)
  • Der vollständige Inhalt aller Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Offenbarung zitiert sind, ist hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, als ob von jeder einzelnen Veröffentlichung, jedem einzelnen Patent oder jeder einzelnen Patentanmeldung speziell und individuell angegeben wäre, dass sie durch Bezugnahme eingeschlossen sei.
  • Obwohl die vorausgehende Erfindung mittels Veranschaulichung und Beispiel zu Zwecken der Klarheit des Verstehens recht detailliert beschrieben wurde, wird einem Fachmann auf dem Gebiet im Licht der Lehren dieser Erfindung leicht offensichtlich sein, dass Änderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne den Geist und den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die folgenden Beispiele werden nur zu Erläuterungszwecken bereitgestellt und sollen den Rahmen der Erfindung nicht einschränken, welcher in breiten Begriffen oben beschrieben wurde.
  • In den folgenden Beispielen ist das hGH jenes von SEQ ID NO: 1. Es wird verstanden, dass andere Mitglieder der hGH-Familie von Polypeptiden oder der entsprechenden Familie der Agonistenvariante davon ebenfalls in einer ähnlichen Weise, wie in den nachfolgenden Beispielen erläuternd dargestellt, PEGyliert werden könnten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Verzweigtes PEG-Butyrylaldehyd-hGH mit MG 40.000
    Figure 00340001
  • Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zum Erzeugen von im Wesentlichen homogenen Präparationen von N-terminal mono-PEGyliertem hGH durch reduktive Alkylierung. Verzweigtes Methoxy-PEG-Butyrylaldehyd-Reagens mit einem MG von etwa 40.000 (Shearwater Corp.) wurde selektiv über reduktive Aminierung an den N-Terminus von hGH gekuppelt, indem ein Vorteil aus dem Unterschied des relativen pKa-Wertes des primären Amins am N-Terminus gegenüber den pKa-Werten der primären Amine an der ε-Amino-Position von Lysinresten gezogen wurde. Das hGH-Protein, gelöst zu 10 mg/ml in 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0, (gegebenenfalls 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, 10 mM Natriumacetat (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5), wurde mit Methoxy-PEG-Butyrylaldehyd, M-PEG-ALD, (Shearwater Corp., Huntsville, AL) durch Zugabe von M-PEG-ALD unter Erhalt eines relativen Molverhältnisses PEG:hGH von 2:1 umgesetzt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe einer Stammlösung ("stock") von 1 M NaCNBH4 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), gelöst in H2O, bis zu einer Endkonzentration von 10–50 mM katalysiert. Die Reaktionen wurden im Dunklen bei Raumtemperatur für 18–24 Stunden durchgeführt. Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 M Tris (Sigma Chemical, St. Louis, MO), ~pH 7,6, bis zu einer Tris-Endkonzentration von 50 mM gestoppt oder für eine unmittelbare Aufreinigung in einem geeigneten Puffer verdünnt.
  • Tabelle 1 zeigt die Prozentsätze, wie bestimmt durch Größenausschlusschromatographie, an multi-PEGylierten Spezies, mono-PEGyliertem Konjugat, nicht-reagiertem PEG und die letztendliche Aufreinigungsausbeute für 40K verzweigten PEG-Aldehyd und 40K verzweigten PEG-Butyrylaldehyd. Der PEG-Butyrylaldehyd resultiert in erhöhtem Mono-PEGyliertem Konjugat, verringerten Leveln an nicht-reagiertem PEG und einer erhöhten Endausbeute verglichen mit PEG-Aldehyd. TABELLE 1
    Vergleich von 40K verzweigtem PEG-ALD-hGH und 40K verzweigtem PEG-Butyrylaldehyd-hGH
    Spezies im Reaktionsgemisch:
    40K PEG-Aldehyd-hGH 40K PEG-Butyrylaldehyd-hGH
    multi-PEG-Produkt 4,02% 5,03%
    mono-PEG-Produkt 48,70% 61,02%
    nicht-reagiertes hGH 41,80% 29,20%
    letztendliche Aufreinigungsausbeute 30,80% 44,70%
  • Beispiel 2
  • Geradkettiges PEG-Butyrylaldehyd-hGH mit MG 30.000
  • Lineares Methoxy-PEG-Butyrylaldehyd-Reagens mit MG 30.000 wird an den N-Terminus von hGH unter Verwendung der für Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise gekuppelt.
  • Beispiel 3
  • Geradkettiges PEG-Butyrylaldehyd-hGH mit MG 20.000
  • Lineares Methoxy-PEG-Butyrylaldehyd-Reagens mit MG 20.000 wird an den N-Terminus von hGH unter Verwendung der für Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise gekuppelt.
  • Beispiel 4
  • Aufreinigung von PEGyliertem hGH
  • PEGylierte hGH-Spezies werden aus dem Reaktionsgemisch bis zu > 95% (SEC-Analyse) unter Verwendung eines einzelnen Ionenaustauscherchromatographieschritts aufgereinigt.
  • Anionenaustauscherchromatographie
  • Die PEG-hGH-Spezies werden aus dem Reaktionsgemisch bis zu > 95% (SEC-Analyse) unter Verwendung eines einzelnen Anionenaustauscherchromatographieschritts aufgereinigt. Mono-PEGyliertes hGH wurde von nicht-modifiziertem hGH und multi-PEGylierten hGH-Spezies unter Verwendung von Anionenaustauscherchromatographie gereinigt. Ein typisches 20K Butyrylaldehyd-hGH-Reaktionsgemisch (5–100 mg Protein), wie oben beschrieben, wurde über eine Q-Sepharose Hitrap-Säule (1 oder 5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) oder eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (26/20, 70 ml Bettvolumen) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), equilibriert in 25 mM HEPES, pH 7,3 (Puffer A), gereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde 5–10× mit Puffer A verdünnt und mit einer Flussra te von 2,5 ml/min auf die Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit 8 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Nachfolgend wurden die verschiedenen hGH-Spezies von der Säule in 80–100 Säulenvolumina Puffer A und einem linearen NaCl-Gradienten von 0–100 mM eluiert. Der Eluent wurde über die Absorption bei 280 nm (A280) überwacht, und 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden entsprechend dem Maß der PEGylierung vereinigt, z.B. mono-, di-, tri etc. (wie in Beispiel 15 bewertet). Der Pool wurde dann auf 0,5–5 mg/ml in einem Centriprep YM10-Konzentrator (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA) konzentriert. Die Proteinkonzentration des Pools wurde über A280 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,78 bestimmt.
  • Kationenaustauscherchromatographie
  • Kationenaustauscherchromatographie wird über einen SP Sepharose High Performance-Säule (Pharmacia XK 26/20, 70 ml Bettvolumen), equilibriert in 10 mM Natriumacetat, pH 4,0 (Puffer B), durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird 10× mit Puffer B verdünnt und mit einer Flussrate von 5 ml/min auf die Säule aufgegeben. Als Nächstes wird die Säule mit 5 Säulenvolumina Puffer B, gefolgt von 5 Säulenvolumina 12% Puffer C (10 mM Acetat, pH 4,5, 1 M NaCl), gewaschen. Nachfolgend werden die PEG-hGH-Spezies von der Säule mit einem linearen Gradienten von 12 bis 27% Puffer C in 20 Säulenvolumina eluiert. Der Eluent wird bei 280 nM überwacht, und 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen werden gemäß dem Maß der PEGylierung (mono-, di-, tri- etc.) vereinigt, es wird ein Pufferaustausch in 10 mM Acetatpuffer, pH 4,5, durchgeführt, und es wird auf 1–5 mg/ml in einer gerührten Zelle, ausgestattet mit einer Amicon YM10-Membran, konzentriert. Die Proteinkonzentration des Pools wird über A280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,78 bestimmt.
  • Beispiel 5
  • Biochemische Charakterisierung
  • Die Pools des gereinigten PEGylierten hGHs wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE, nicht-denaturierender Größenausschlusschromatographie und Peptidkartierung charakterisiert.
  • Größenausschlusschromatographie mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ("Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography") (SEC-HPLC)
  • Nicht-denaturierende SEC-HPLC
  • Die Reaktion von Methoxy-PEG der verschiedenen chemischen Anfügungen ("attachment chemistries"), Größen, Linker und Geometrien mit hGH, Anionenaustauscheraufreinigungspools und aufgereinigte Endprodukte wurden unter Verwendung von nicht-denaturierender SEC-HPLC bewertet. Analytische nicht-denaturierende SEC-HPLC wurde unter Verwendung einer Säule, Superdex 200, 7,8 mm × 30 cm (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ), in 20 mM Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, bei einer Flussrate von 0,5 ml/min (gegebenenfalls Tosohaas G4000PWXL, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) durchgeführt. Die PEGylierung erhöht das hydrodynamische Volumen des Proteins erheblich, was in einer Verschiebung zu einer früheren Retentionszeit hin resultiert. Neue Spezies wurden in den PEG-Aldehyd-hGH-Reaktionsgemischen neben nicht-modifiziertem hGH beobachtet. Diese PEGylierten und nicht-PEGylierten Spezies wurden über Q-Sepharose-Chromatographie getrennt, und es wurde nachfolgend gezeigt, dass die resultierenden gereinigten Mono-PEG-Aldehyd-hGH-Spezies als Einzelpeak in der nicht-denaturierenden SEC (> 95% Reinheit) eluierten. Der Q-Sepharose-Chromatographieschritt entfernte wirksam freies PEG, hGH und multi-PEGylierte hGH-Spezies von dem mono-PEGylierten hGH.
  • Denaturierende SEC-HPLC
  • Die Reaktion des Butyrylaldehyd-Polyethylenglykols mit hGH, Anionenaustauscheraufreinigung und aufgereinigte Endprodukte werden unter Verwendung von denaturierender SEC-HPLC bewertet. Analytische denaturierende SEC-HPLC wird unter Verwendung einer Tosohaas 3000SWXL-Säule, 7,8 mm × 30 m (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in 100 mM Phosphat, pH 6,8, 0,1% SDS, bei einer Flussrate von 0,8 ml/min durchgeführt. Die PEGylierung erhöht das hydrodynamische Volumen des Proteins erheblich, was in einer Verschiebung zu einer früheren Retentionszeit hin resultiert. PEGylierte und nicht-PEGylierte Spezies werden über Q-Sepharose-Chromatographie getrennt.
  • SDS-PAGE/PVDF-Transfer
  • SDS-PAGE wurde verwendet, um die Reaktion von PEG-Butyrylaldehyd mit hGH und die aufgereinigten Endprodukte zu beurteilen. SDS-PAGE wurde mit 1 mm dicken 10–20% Tris-Tricin-Gelen (Invitrogen, Carlsbad, CA) unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt und unter Verwendung eines Novex Colloidal Coomassie G-250-Färbe-Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA) gefärbt. Die Banden werden auf PVDF-Membran für eine nachfolgende N-terminale Sequenzidentifizierung geblottet.
  • Analytische Anionenaustauscher-HPLC
  • Das PEG-Butyrylalhdehyd/hGH-Reaktionsgemisch, Anionenaustauscheraufreinigungsfraktionen und gereinigte Endprodukte wurden unter Verwendung von analytischer Anionenaustauscher-HPLC bewertet. Analytische Anionenaustauscher-HPLC wurde unter Verwendung einer Tosohaas Q5PW- oder DEAE-PW-Anionenaustauschersäule, 7,5 mm × 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in 50 mM Tris, pH 8,6, bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt. Die Proben wurden mit einem linearen Gradienten von 5–200 mM NaCl eluiert.
  • N-terminale Sequenz und Peptidkartierung
  • Automatisierte Edman-Abbau-Chemie wurde verwendet, um die NH2-terminale Proteinsequenz zu bestimmen. Ein Applied Biosystems Model 494 Procise-Sequenzer (Perkin Elmer, Wellesley, MA) wurde für den Abbau eingesetzt. Die entsprechenden PTH-As-Derivate wurden mittels RP-HPLC-Analyse in einer Online-Weise unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 140C PTH-Analysators, ausgestattet mit einer PTH-C18-Säule, Perkin Elmer/Brownlee, 2,1 mm Id, identifiziert.
  • Tryptischer Verdau wurde bei einer Konzentration von 1 mg/ml durchgeführt, und typischerweise werden 50 μg Material pro Verdau verwendet. Trypsin wurde derart zugegeben, dass das Trypsin zu PEG-hGH-Verhältnis 1:30 (G/G) betrug. Tris-Puffer war mit 30 mM, pH 7,5, vorhanden. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 16 ± 0,5 Stunden inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 μl 1 N HCl pro ml Verdaulösung gequencht.
  • Die Proben wurden vor dem Platzieren der Proben in dem Autosampler auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml in 6,25% Acetonitril verdünnt. Acetonitril wurde zuerst zugegeben (bis 19,8% Acetonitril), es wurde vorsichtig gemischt, und anschließend wurde Wasser bis zum Endvolumen (das Vierfache des Ausgangsvolumens) zugegeben. Überschüssige Verdaulösung ("extra digestion solution") kann entfernt und für bis zu 1 Woche bei –20°C gelagert werden.
  • Ein Waters Alliance 2695-HPLC-System wurde zur Analyse verwendet, aber andere Systeme sollten ähnliche Ergebnisse produzieren. Die verwendete Säule war eine Astec C-4 polymeric-Säule, 25 cm × 4,6 mm, mit 5 μm-Partikeln. Die Versuche wurden bei Raumtemperatur bei einer typischen Aufgabe von 50 μg Protein pro Probe durchgeführt. Puffer A ist 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser; Puffer B ist 0,085% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Der Gradient war wie folgt:
    Zeit A% B% C% D% Fluss Kurve
    0,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 1
    90,00 0,0 0,0 55,0 45,0 1,000 6
    90,10 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6
    91,00 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6
    91,10 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6
    95,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6
  • Die Säule wird unter Verwendung eines Heizmantels auf 40°C erwärmt. Die Peaks wurden unter Verwendung eines Waters 996 PDA-Detektors detektiert, welcher Daten zwischen 210 und 300 nm aufnimmt. Das daraus entnommene Chromatogramm bei 214 nm wurde zur Probenanalyse verwendet.
  • Kartierungen nach tryptischem Verdau ("tryptic maps") wurden für hGH, 40K verzweigten PEG-Aldehyd und 40K verzweigten Butyrylaldehyd durchgeführt (1). Das N-terminale Fragment aus dem Trypsinverdau ("tryptic fragment") wurde als T-1 bezeichnet. Der Prozentsatz an vorhandenem T-1, verglichen mit nicht-PEGyliertem hGH ist in Tabelle 2 gezeigt. Diese Daten legen nahe, dass bei Verwendung von PEG-Aldehyd 90% der PEG-Modifizierung an dem N-Terminus vorliegt, wobei der Rest offenbar mit einem der mehreren möglichen Lysinreste verknüpft ist, verglichen mit mehr als 98% am N-Terminus bei Verwendung von PEG-Butyrylaldehyd. TABELLE 2
    % vorhandenes T-1 % vorhandenes T-1 im Vergleich zu nicht-PEGyliertem hGH
    hGH 28,0%
    PEG-Aldehyd/hGH 2,6% 9,2%
    PEG-Butyrylaldehyd/hGH 0,3% 1,2%
  • Beispiel 6
  • Pharmakodynamische Studien
  • Gewichtszunahme bei Ratten
  • Weibliche Sprague-Dawley-Ratten, die bei Taconic Labs einer Hypophysektomie unterzogen wurden, wurden bezüglich der Wachstumsrate für eine Dauer von 7 bis 11 Tagen einer Vorauswahl unterzogen ("prescreened"). Die Ratten wurden in Gruppen von acht aufgeteilt. Gruppe 1 bestand aus Ratten, denen entweder täglich oder am Tag 0 und am Tag 6 eine subkutane Dosis von Vehikel gegeben wurde. Gruppe 2 wurde täglich eine subkutane Dosis von GH (30 μg/Ratte/Dosis) gegeben. Gruppe 3 wurde subkutane Dosen von GH am Tag 0 und am Tag 6 (180 μg/Ratte/Dosis) gegeben. Gruppe 4 wurde subkutane Dosen von 40K verzweigtem PEG-Butyrylaldehyd-hGH am Tag 0, 6 (180 μg/Ratte/Dosis) gegeben. Ratten mit Hypophysektomie wurden hinsichtlich Gewichtszunahme durch Wiegen an mindestens jedem zweiten Tag während der Studie überwacht. 3 & 4.
  • Tibia-Länge der Ratten
  • Die Tiere in den 11 Tage-Gewichtszunahme-Studien wurden am Tag 11 getötet, die linken Tibiae wurden entfernt und geröntgt, und die Knochenlängen wurden unter Verwendung eines Messschiebers gemessen. 5.
  • IGF-1-Studien
  • Tiere aus Sechs-Tage-Gewichtszunahme-Studien wurden verwendet. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeiten während der Studie abgenommen, und die Serum-IGF-1-Spiegel mittels ELISA bestimmt. 6.
  • Serum-Biochemie-Studien
  • Die Tiere in 11-Tage-Gewichtszunahme-Studien wurden verwendet, um die Serum-Biochemie-Werte am Tag 7 nach einer kumulativen Verabreichung von 1,8 mg/kg am Tag 0 und 6 zu beurteilen, wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Assay Vehikel hGH (11 Tage bei 300 μg/kg/Tag) PEG-hGH (1,8 mg/kg am Tag 0 und 6)
    ALB (g/dl) 4,07 ± 0,04 4,06 ± 0,05 4,18 ± 0,03*†
    ALP (U/l) 311 ± 15 309 ± 16 280 ± 14
    ALT (U/l) 53,6 ± 2,4 51,1 ± 2,2 51,3 ± 2,6
    AST (U/l) 149 ± 7 131 ± 4 137 ± 11
    BUN (mg/dl) 37,4 ± 1,6 26,7 ± 1,5* 27,9 ± 0,6*
    Ca2+ (mg/dl) 10,9 ± 0,1 11,5 ± 0,1* 11,0 ± 0,1†
    Chol (mg/dl) 85,1 ± 2,8 76,9 ± 3,6* 115,3 ± 2,8*†
    CRE (mg/dl) 0,62 ± 0,02 0,60 ± 0,01 0,59 ± 0,01
    Glucose (mg/dl) 73,4 ± 4,7 79,6 ± 4,7 67,1 ± 8,9
    Phos (mg/dl) 8,26 ± 0,28 9,59 ± 0,16* 8,42 ± 0,23†
    TP (g/dl) 6,36 ± 0,10 6,48 ± 0,10 6,39 ± 0,06
    TBA (μmol/l) 10,0 ± 0,5 7,6 ± 0,4* 11,0 ± 0,4†
    SDH (U/l) 11,9 ± 1,0 9,7 ± 1,4 10,6 ± 0,7
    Triglyceride (mg/dl) 57,4 ± 4,0 47,8 ± 5,7 45,7 ± 3,9*
    LDH (U/l) 786 ± 72 762 ± 94 914 ± 189
    Na+ (mmol/l) 147 ± 0,5 146 ± 0,8 145 ± 0,6*
    K+ (mmol/l) 5,94 ± 0,09 6,31 ± 0,16* 6,71 ± 0,17*†
    Cl– (mmol/l) 103 ± 0,5 102 ± 0,5 102 ± 0,6
    • *p < 0,10 vs Vehikel, † p < 0,05 vs hGH ALB, Albumin, ALP, Alkalische Phosphatase, ALT, Alaninaminotransferase, AST, Aspartataminotransferase, BUN, Blutharnstoffstickstoff, Ca2 +, Calcium, Chol, Cholesterin, CRE, Kreatinin, Phos, Phosphat, TP, Gesamtprotein, TBA, Gesamtgallensäure, SDH, Sorbitdehydrogenase, LDH, Lactatdehydrogenase ("lactic dehydrogenase"), Na+, Natrium, K+, Kalium, Cl–, Chlor.
  • Die Blutharnstoffstickstoff-Konzentration am Tag 11 verringerte sich signifikant (p < 0,10) um die gleiche Höhe bei den hGH- und PHA-794428-behandelten Tieren in Relation zur Vehikelgruppe. Dies ist ein Anzeichen einer zunehmenden Stickstoff-Verwendung als Ergebnis der neuen Proteinsynthese während dem verstärkten Wachstum.
  • Pharmakokinetische Studien
  • Pharmakokinetische Studien wurden bei normalen männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit eingeführter Kanüle durchgeführt. Injektionen wurden als einzelner subkutaner Bolus von 100 μg/kg/Ratte GH oder PEG-GH unter Verwendung von sechs Ratten pro Gruppe durchgeführt. Blutproben wurden über einen bis fünf Tage, wie angemessen, zur Beurteilung der relevanten PK-Parameter abgenommen. GH- und PEG-GH-Blutspiegel wurden bei jeder Probennahme unter Verwendung eines Immunoassays überwacht.
  • hGH-Immunoassay
  • hGH- und PEGyliertes hGH-Protein-Konzentrationsspiegel im Plasma von Mäusen und Javaneraffen ("cynomolgus monkey") wurden unter Verwendung eines hGH-Fluoreszenz-Immunoassays, AutoDELFIA-Kit, (Perkin Elmer) bestimmt. Die IGF-1-Spiegel bei Ratten und Menschen wurden mittels eines Immunoassay-Kits (Diagnostic System Laboratories) überwacht.
  • Nicht-kompartimentelle ("non-compartmental") pharmakokinetische Eigenschaften für das hGH-PEG-Konjugat aus Beispiel 1 bei nicht-menschlichen Primaten
  • Das hGH-PEG-Konjugat aus Beispiel 1 wurde an Javaneraffen als intravenöse (iv) oder subkutane (sc) Bolusinjektionen mit 0,18 mg/kg verabreicht (Tabelle 4). Die PK-Parameter wurden unter Verwendung der Mittelwertsdaten für n = 3 Tiere bestimmt. Die Plasmakonzentrationen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Immunoassays, Auto-DELFIA-Kit, (Perkin Elmer) und einer Standardkurve, die zuvor für das PEG-GH-Konjugat bestimmt wurde, gemessen. Tabelle 4
    Dosis (mg/kg) iv 0,18/sc 0,18
    CL, iv (ml/h/kg) 0,8
    Vss (ml/kg) 28,0
    T1/2, iv (h) 25,0
    T1/2, sc (h) 61,2
    SC AUC (μg/ml·h) 195
    SC Bioverfügbarkeit (%) 84
    Tmax, sc (h) 32
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00420001
  • Figure 00430001

Claims (10)

  1. Verwendung eines Poly(ethylenglykol)-modifizierten hGH mit der Struktur der Formel I oder II,
    Figure 00440001
    Formel I oder mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R Formel IIworin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; R ein humanes Wachstumshormon oder Methionyl-Wachstumshormon ist, allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel in der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung oder Störung, bei der die Verwendung eines Wachstumshormons vorteilhaft ist, wobei die Erkrankung oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus traumatischer Hirnverletzung, Subarachnoidalblutung, Noonan-Syndrom, idiopathischem Kleinwuchs (ISS), sehr geringem Geburtsgewicht (VLBW), Kleinwuchs bei Kindern aufgrund von Glucocorticoidbehandlung und Wachstumsrückstand, der kleine Frühgeborene erfasst.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Erkrankung oder Störung, bei der die Verwendung von GH vorteilhaft ist, ISS ist.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei n gleich 4 und m gleich 3 ist.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH die Struktur der Formel I hat, wobei n gleich 4 ist und m gleich 3 ist.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das humane Wachstumshormon die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei mehr als 90% des Polyethylenglykols mit einem aminoterminalen Phenylalanin der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 konjugiert sind.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei mehr als 95% des Polyethylenglykols mit einem aminoterminalen Phenylalanin der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 konjugiert sind.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jedes mPEG ein Molekulargewicht von etwa 20 kDa hat.
  9. Zusammensetzung, umfassend das humanes Wachstumshormon-PEG-Konjugat der Formel I oder II in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel und mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Träger:
    Figure 00460001
    Formel I oder mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R Formel IIworin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; m eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; R humanes Wachstumshormon oder Methionyl-Wachstumshormon ist.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Poly(ethylenglykol)-modifizierte hGH die Struktur der Formel I hat, wobei n gleich 4 ist und m gleich 3 ist.
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