DE2516274C2

DE2516274C2 - Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten Zytomegalie-Virus-Impfstoffes

Info

Publication number: DE2516274C2
Application number: DE2516274A
Authority: DE
Inventors: Stanley A. Philadelphia Pa. Plotkin
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1974-04-15
Filing date: 1975-04-14
Publication date: 1986-10-30
Also published as: FR2267117A1; CA1045546A; NL7504480A; AU8002475A; SE7504221L; GB1501724A; DE2516274A1; FR2267117B1; US3959466A; CH617588A5; ZA751949B; BE827572A; JPS58406B2; JPS5115612A

Description

a) wenigstens lOmaliges Passagieren von CMV durch menschliche dtploide Lungenfibroblasten der Zugangsnummern ATCC CCL 75 oder ATCC CCL171 bis zur Freisetzung großer Mengen an zellfreiem CMV,

b) Gewinnen der zellfreien, CMV enthaltenden Flüssigkeit durch mechanisches Abtrennen,

c) Attenuieren dieses zellfreien Mediums durch 50- bis 150maliges Passagieren in frischen menschlichen Lungenfibroblasten der Zugangsnummern ATCC CCL 75 oder ATCC CCL 171, wobei jede Passage 5 bis 10 Tage dauert und bei einer Temperatur von 30 bis 37° C durchgeführt wird,

d) gegebenenfalls Kultivieren des abgeschwächten Virus in den menschlichen diploiden Lungenfibroblasten der Zugangsnummern ATCC CCL 75 oder ATCC CCL 171 und Abernten des erhaltenen abgeschwächten CMV daraus.

2, Zytomegalie-Virus-lmpfstoff, enthaltend als Wirkstoff das nach Anspruch 1 abgeschwächte und vermehrte Zytomegalie- Virus.

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Die Infektion mit Zytomegalie-Virus (CMV) in der Gebärmutter ist ein wichtiger Anlaß der Schädigung des Zentralnervensystems bei Neugeborenen. Obgleich der Virus unter der Bevölkerung weit verbreitet ist, treten etwa 40% der Frauen ohne Antikörper in die Schwangerschaft ein und sind so für die Infektion empfänglich. Etwa 1% dieser Frauen unterliegt der Primärinfektion in der Gebärmutter. Die klassische Zytomegalie ist selten; jedoch findet man einen Teil der infizierten Säuglinge, einschließlich derjenigen, die symptomfrei waren, später geistig zurückgeblieben (Lancet, 5. Januar 1974, S. 1-5).

Vorläufige Schätzungen, welche sich auf die Überwachung von etwa 4000 Neugeborenen aus einigen geographischen Bezirken gründen, zeigen, daß der Virus bedeutende Schädigung des Zentralnervensystems verursacht, was zu geistiger Unzulänglichkeit in mindestens 10% und vielleicht so hoch wie 25% der infizierten Säuglinge führt. Unter der Annahme, daß etwa 1% der pm Jahr neugeborenen Säuglinge CMV absondern und daß etwa ein Viertel von diesen geistige Mangel zeigen, bedeutet dies in den Vereinigten Staaten etwa 10 000 hirngeschädigte Kinder, welche im Jahr geboren werden. Dies ist eine erschreckende Anzahl, insbesondere im Hinblick auf die Fähigkeit dieser Kinder, zu überleben (J. of Infect. Dis., 123, Nr. 5,555; Mai 1971).

Angesichts der Ernsthaftigkeit des Problems wurden in jüngeren Jahren Forschungen angeregt, weiche auf die Entwicklung eines wirksamen CMV-Impfstoffes gerichtet warea Das Problem zu Impfung besteht darin, durch Zellen vermittelte und humorale Immunität herbeizuführen, ohne Ausbreitung des Virus über den ganzen Körper des Geimpften und ohne Herbeiführung von Krankheitswirkungen.

Der Impfstoff sollte brauchbar sein, um Frauen gegen Infektion während der Schwangerschaft zu schützen. Die Impfung junger Mädchen sollte den Zwischenfall der primären CMV-Infektion in der Schwangerschaft herabsetzen und fötale Hirnschädigung infolge dieses Anlasses abwenden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten Zytomegalie-Virus-Impfstoffes durch Passagieren von Zytomegalie-Viren (CMV) auf menschlichen diploiden Lungenfibroblasten, gekennzeichnet durch

a) wenigstens lOmaliges Passagieren von CMV durch menschliche diploide Lungenfibroblasten der Zugangsnummera ATCC CCL 75 oder ATCCCCL171 bis zur Freisetzung großer Mengen an zellfreiem CMV,

c) Attenuieren dieses zellfreien Mediums durch 50-bis 150maliges Passagieren in frischen menschlichen Lungenfibroblasten der Zugangsnummern ATCC CCL 75 oder ATCC CCL171, wobei jede Passage 5 bis 10 Tage dauert und bei einer Temperatur von 30 bis 37° C durchgeführt wird,

d) gegebenenfalls Kultivieren des abgeschwächten Virus in den menschlichen diploiden Lungenfibroblasten der Zugangsnummern ATCC CCL 75 oder ATCCCCL 171 und Abernten des erhaltenen abgeschwächten CMV daraus.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff kann Immunität gegen CMV herbeiführen und ist daher brauchbar, Frauen gegen Infektion während der Schwangerschaft zu schützen, wodurch Schädigung des Zentralnervensystems einschließlich geistigen Zurückbleibens von Neugeborenen stark herabgesetzt werden kann.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff zeigt vorteilhafterweise kein Ausbreiten des Virus auf Kontaktpersonen. Ferner besitzt der Impfstoff wegen der Art seiner Herstellung nicht die Fähigkeit, latenten tierischen Virus auf Geimpfte zu übertragen.

so Ein wesentliches Merkmal des ilerstellungsverfahrens des Impfstoffes ist das Passagieren von Megalozytenvirus in diploide Fibroblaste der menschlichen Lungen, insbesondere WIO-38- und MRC-5-Fibroblaste, vorzugsweise die ersteren.

Die WI-38-Fibroblaste wurden ursprünglich von einem einzigen menschlichen Lungenflügel abgeleitet; sie sind stammbaummäßig erfaßt in dem Sinne, daß sie umfassend biologisch, biochemisch, virologisch und genetisch gekennzeichnet worden sind. Die MRC-5-Fibroblaste wurden in ähnlicher Weise von einem einzigen menschlichen Lungenflügel abgeleitet, jedoch eines unterschiedlichen Individuums, und sind in ähnlicher Weise stammbaummäßig erfaßt. Diese beiden Zellenlinien sind standardisiert im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten primären tierischen Zellen. WI-38 ist beschrieben in Expcr. Cell Res., 25, 585; 1961, und wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection und trägt die Bezeichnung ATCCCCL-75. MRC-5 ist

beschrieben in Nature, 27, 168; 11. Juli 1970. WI-38 ist den Laboratorien zugänglich gemacht worden und kann von der Collection erhalten werden. Die Verwendung dieser Zellenlinien zur Fortpflanzung des Virus setzt die Wahrscheinlichkeit auf ein Mindestmaß herab, daß latente tierische Viren auf einen Geimpften mittels des Impfstoffes übertragen werden.

Der Towne-Stamm von CMV, ein bevorzugter Stamm zur Verwendung bei der Herstellung des Impfstoffes wegen seines breiten antigenen Spektrums, wurde isoliert aus dem Urin eines zwei Monate alten männlichen Säuglings mit megalozytärer Einschlußkrankheit (Symptome: Schädigung des Zentralnervensystems und Hepatosplenomegalie). Dieser CMV-Stamm wurde isoliert von Stanley A. Plolkin, Wistar Institute of Anatomy is and Biology, Philadelphia, Pennsylvanien, und ist in J. Virol, 11, Nr. 6,991; Juni 1973, beschrieben. Jedoch können auch andere Stämme von CMV verwendet werden.

Die Fortpflanzung der diploiden Fibroblaste der menschlichen Lunge kann nach irgendeiner der in de? 20 Literatur beschriebenen Standardmethoden durchgeführt werden. Spezifische Beispiele solcher Fortpflanzungstechniken sind in Exper. Cell Res, 25, 585; 1961, und in Virology, 16,147; 1962, beschrieben. Das Gewebekultursystem weist gewöhnlich Eagles Grundmedium (BME) oder Eagles Minimal-Essential-Medium (MEM) in Eagles Restsalzlösung auf, ergänzt mit vorgesichtetem Kalbserum, welches eine sterilisierende Menge eines Antibiotikums wie Penicillin, Streptomycin, Chlortetracyclin oder eines anderen Antibiotikums oder Gemisehe solcher enthält, wobei das System bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bhi 8,5 mit einem herkömmlichen biologischen Fuffermititel wie Alkalicarbonat, -carbonat oder -hydrogenphosphat gepuffert ist.

Der CMV wird zum hnpfstorfgübrauch kultiviert, indem man diploide Fibroblaste der mei.jchlichen Lunge mit CMV inokuliert CMV-haltiger Urin ist ein besonders brauchbares Ausgangsmaterial zum Inokulieren der Fibroblaste. Die trypsinierten infizierten Zellen werden gewonnen und laufend in diploide Fibroblaste der menschlichen Lungen eingegeben. Jede Inkubation währt sieben Tage und. wild bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt. Die Anzahl an Durchgängen ist eine solch«;, daß zunächst ein CMV-Stamm erzeugt wird, welcher große Mengen an zellfreiem Virus freisetzt, wonach die Abschwächung des zellfreien Virus folgt. Mindestens etwa 50 und vorzugsweise etwa 125 bis 150 Gesamtdurchgänge werden angewandt Der abgeschwächte Virus wird dann gewonnen und genormten Sterilitätstests auf Anwesenheit von Bakterien, Pilzen, Mykoplasma und anderen verunreinigenden Stoffen unterworfen.

Der Ausdruck »abgeschwächter Virus«, wie er hier gebraucht wird, bezieh): sich auf einen Virus, dessen Bösartigkeit durch die Methode der Kultivierung abgeänden worden ist, so daß der Virus keine schwerwiegenden Symptome hervorruft, wenn er dem Menschen eingeimpft wird, obgleich der Virus seine Antigenauslösung, d. h. seine Fähigkeit, die Erzeugung von Antikörpern anzuregen, beibehält. ω

Der abgeschwächte Virus wird als Impfstoff verwendet, indem man das gewonnene Material filtriert, um Zellen bzw. Bakterien zu entfernen, und das Filtrat verwendet man entweder so, wie es ist, für späteren Gebrauch gefroren oder lyophilisiert und anschließend mit einem Lösungsmittel wie Wasser wiederhergestellt. Wenn das Filtrat lyophilisiert wird, verwendet man vorzuesweise einen Stabilisator wie Albumin. Der Impfstoff kann subkutan verabreicht werden. Die Dosis, welche angewandt werden kann, ist mindestens 100 TCID₅₀ an abgeschwächtem CMV und kann so hoch sein wie 10 00OTCID₅₀.

Der abgeschwächte Virus kann in größeren Mengen hergestellt werden, indem man diploide Fibroblaste der menschlichen Lunge mit dem Virus inokuliert und den abgeschwächten Virus darin wachsen läßt. Der abgeschwächte Virus kann zur Zeit des maximalen Titers, beispielsweise in etwa einer Woche, gewonnen werc'en.

Die folgende Beschreibung der Herstellung und des Testens des CMV-Impfstoffes soll lediglich der Veranschaulichtung der Erfindung dienen, jedoch über den Rahmen der Erfindung nichts aussagen.

Gewinnen des Virus

Den verwendeten CMV gewinnt man aus dem Urin eines zwei Monate alten, männlichen menschlichen Säuglings mit megalozytärer Einschlußkrankheit. Dieser Stamm wird als Towne-Stamm bezeichnet und ist weiter oben beschrieben. Den Urin inokuliert man auf diploide Fibroblaste WI-38 der menschlichen Lunge. Das zur Gewebekultur des Virus verwendete Nährmedium ist Eagles Minimal-Essential-Medium (MEM) mit 2% zugesetztem vorgesichtetem Kalbserum. Die Konzentration an Antibiotika je ml Medium beträgt 100 μg Penicillin, 10 μg GentaifMcin und 2 μg Amphotericin-B. Anstelle dieser oben speziell aufgezählten Antibiotika können auch andere verwendet werden.

Herstellen des abgeschwächten CMV

Die Ernte, bestehend aus überstehender Flüssigkeit und virusinfizierten Zellen, welch letztere von der Oberfläche der Gefäße unter Verwendung von 0,25% Trypsin in physiologischer Kochsalzlösung entfernt werden, inokuliert man auf stationären diploiden Fibroblasten WI-38 der menschlichen Lunge zum Ingangsetzen der Infektion dieser Zellen, und dann wird Me anschließend hindurchgegeben. Das Nährmedium, welches zum Einleiten der Zellinfektion und in allen darauffolgenden Durchgängen verwendet wird, ist das gleiche wie dasjenige, welches, wie oben beschrieben, für die Gewebekultur des Virus verwendet wird. Die in jedem Durchgang angewandte Temperatur beträgt 37° C. Jedoch können auch Temperaturen etwas unterhalb dieser Temperatur, beispielsweise Temperaturen im Bereich von etwa 30 bis 37° C, angewandt werden. Die Dauer jedes Durchgangs beträgt 7 Tage, doch können auch Gänge etwas kürzerer oder längerer Dauer, beispielsweise 5 oder 10 Tage, angewandt werden.

Bei den anfänglichen Durchgängen, welche zahlenmäßig etwa 10 sind, läßt man überstehende Flüssigkeit, welche virusinfizierte Zellen enthält, die von jedem vorherigen Durchgang gewonnen wurden, auf frischen diploiden Fibroblasten WI-38 der menschlichen Lunge durchgehen. Bei jedem Durchgang verwendet man etwa 25% zellhaltiger Flüssigkeit aus einem vorhergehenden Durchgang. Die gewählte Anzahl an Durchgängen ist eine solche, daß ein Stamm erhalten wird, welcher eine wesentliche Menge an zellfreiem Virus erzeugt, wobei der CMV gewöhnlich mit Zellen assoziiert ist. Eine etwas kleinere oder größere Anzahl an Durchgängen kann daher angewandt werden.

Die überstehende Flüssigkeit vom zehnten Durchgang erhält man durch Abdekantieren und Zentrifugieren bei 1200 U/min, wobei man eine Flüssigkeit gewinnt,

welche zellfreien Virus enthält Die zellfreie Flüssigkeit, welche zellfreien Virus enthält, läßt man dann nacheinander 28mai auf frischen diploiden Fibroblasten WI-38 der menschlichen Lunge passieren, wobei man 1 ml der Flüssigkeit benutzt, um Gefäße zu inokulieren, von denen ein jedes einen Oberflächenbereich von 75 cm² besitzt Wenn auch 28 Durchgänge angewandt werden, so braucht doch die Anzahl Durchgänge bloß ausreichend zu sein, um die gewünschte Menge an zellfreiem CMV hervorzubringen. Eine größere oder geringere Anzahl an Durchgängen der zellfreien Flüssigkeit könnte daher angewandt werden.

Die überstehende Flüssigkeit, weiche auch Virus enthalten kann, der durch Beschallung aus Zellen freigesetzt ist wird gewonnen und dann reihenmäßig auf frische WI-38 gegeben, und zwar eine hinreichende Anzahl Male, beispielsweise ?,i5mal, um den Virus abzuschwächen. Die Gesamtanzahl der Durchgänge, welche in oben beschriebenem Gesamtverfahren angewandt werden, beträgt gewöhnlich zwischen etwa 50 und 150, vorzugsweise etwa 125 bis 150.

Das Ansammeln (cloning) des abgeschwächten Viras durch Endverdünnung vollzieht man ha 50, 60 und 70 Durchgängen.

Der Virus für Impfeinsätze wird gewonnen aus überstehenden Flüssigkeiten von infizierten WI-38-Kuituren zur Zeit des maximalen Virustiters, im allgemeinen in etwa einer Woche. Durch diese Arbeitsweise gewinnt man eine größere Menge an abgeschwächtem CMV aus der anfangs bereiteten.

Eigenschaften des CMV-Impfstoffes

Der CMV-Impfstoff wächst auf menschlichen Fibroblasten wie WI-38-Zellen. Seine zellpathogene Wirkung ist charakteristisch für menschliches CMV und in der Literatur beschrieben. Er kann leicht in zellfreier Form fortgepflanzt werden, indem man die überstehende Flüssigkeit der infizierten Kultur filtriert (3-Mikron-Filter) und auf frischen WI-38-Zellen inokuliert CPE erfolgt innerhalb 4 bis 10 Tagen, je nach der Vielfältigkeit der Infektion. Es bilden sich Einschlußkörper, wie dies in der Literatur beschrieben ist, und diese können mit Hämatoxylin-Eosin oder nach Giemsa angefärbt werden. Der abgeschwächte Virus bildet Plättchen mit einer Oberschicht an Nähragarose.

Der Impfstoff sollte bei - 70³C gelagert werden, und zwar in einer Lösung von 70% Sorbit in destilliertem Wasser (ein Volumen Virus auf ein Volumen Sorbitlösung).

Der zellfreie abgeschwächte Virus kann seroneutralisiert werden mit im Handel erhältlichem menschlichem Antiserum, CF-Titer 1:16 (verdünnt 1 :10). 0,1 ml verdünntes Serum neutralisiert 250 TCID50. Hyperimmunes Meerschweinchenserum gegen Stamm AD 169 kann ebenfalls verwendet werden.

Die folgende Tabelle stellt die Titer der Serumneutralisation (SN) allein und in Anwesenheit von Komplement zusammen. Die SN erfolgte in Mikroplättchen (Linbro): 0,025 ml Suspension von 60 TCID₅₀Towne 125 plus 0,025 ml verdünntes Serum. Nach einer Stunde werden 0,250 ml, weiche 10⁴ WI-38-Zellen in Eagles modifiziertem Grundmedium enthalten, mit 10% nicht erwärmtem Kalbserum hinzugegeben. Die Mikroplatten werden nach einer 5- bis 7tägigen Inkubation bei 37°C abgelesen. Man verwendet acht Stufen je Verdünnung.

Serum, Probe

Neutralisation allein mit

Komplement

Kaninchen

Nr. 1

Nr. 2

Nr. 3

Nr. 4

Meerschweinchen
Menschliches
Antiserum

8	8
8	64
8	32
8	64
20-100	100
40	40

Testen des Impfstoffes

Jeden zum Inokulieren verwendeten Einsatz unterwirft man Tests auf Anwesenheit von Bakterien, Pilzen und Mykoplasma durch Inokulieren auf passende künstliehe Medien. Tests auf Sicherheit in Tieren umfassen Injektion von Bruchteilen des Einsatzes in ausgewachsene Mäuse (intraperitoneal und intracerebral), in säugende Mäuse (intraperitoneal und intracerebral), Meerschweinchen (intraperitoneal) und Kaninchen (intradermal). Die Prüfung der Tiere zu verschiedenen Zeiten (sämtlich einige Wochen) nach der Inokulierung zeigt daß alle Tiere gesund blieben.

Zwanzig Cercepithecusaffen werden mit dem Impfstoff inokuliert und zwar mit 0,5 ml intraspinal bzw. intracerebral und mit 1 ml intramuskulär. Sie waren sämtlich seronegativ bis 100 TCID₅₀ CMV-Neutralisation, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit frischen Meerschweinchenkomplements. Die Affen wurden drei Wochen später erneut getestet Es zeigte sich während dieser Beobachtungsdauer bei klinischer und pathologischer Prüfung bei den gleichen Affen keine Serumumwandlung.

Weitere Tests auf Identität und auf Abwesenheit verunreinigender Mittel werden in den Gewebekulturen durchgeführt

Primäre Niere des afrikanischen grünen Affen, Niere des menschlichen Embryos, primäre Niere des Kaninchens und WI-38-Zellen werden sämtlich mit Bruchteilen des Virus inokuliert, und zwar entweder direkt oder nach einstündiger Neutralisation bei 37° C mit Kaninchen-CMV-Serum. Es wurde im Einsatz kein anderer Stoff offenbar als CMV-Impfstoff. Die Titration der Einsätze auf Menge an CMV-Virus vollzieht man durch Endpunktverdünnungsprobe an WI-38-Zellen.

Ergebnisse der Impfstofftests am Menschen

Der Impfstoff wurde an Erwachsenen getestet, welche vorher auf Antikörper gegen CMV geprüft wurden und nur seronegative Personen in die Tests mit einbezogen. Zehn Esronegativen Erwachsenen wurden 10³·⁰ TCID50 intranasai gegeben. Es erfolgten keine Serumumwandlungen, was zeigt, daß der Virus über den üblichen Weg nicht mehr infektiös war. Neun anderen Er-

eo wachsenen wurde die gleiche Dosis subkutan gegeben, und in allen Fällen trat Serumumwandlung ein. Es wurden weder Symptome beobachtet noch w»irde der Virus aus Urin, Kehle oder Blut gewonnen.
Zur Erzielung der vorgenannten Ergebnisse wurden

o5 die Viren in einem Volumen von 1 ml subkutan inokuliert. Kehlenabstriche wurden mit Anwendungsstäbchen mit Baumwollspitze genommen, wobei die Stäbchen über die hintere Pharynx bewegt wurden. Beide

Abstricharten wurden sofort in Schraubstöpselröhrchen gebracht, welche Hanks Medium mit 0,1% Gelatine, 1000 μg Streptomycin und 400 μg Mykostatin je ml enthielten. Die Proben wurden entweder bei 4°C gelagert, bis sie am gleichen Tag in Gewebekulturen inokuliert wurden, oder sie wurden bei -20° C gelagert, bis sie innerhalb von zwei Wochen getestet wurden. Urin wurde direkt auf WI-38-Zellen inokuliert. Blutpräsenztests wurden durchgeführt durch Sammeln heparinisierten Blutes und durch Absetzenlassen des Blutes durch Schwerkraft bei A⁰C, bis ein leukozytenreiches Plasma erhalten wird. Nach zwei Minuten dauernder Beschallung wird das Plasma in Gewebekultur inokuliert. Antikörperstudien wurden durchgeführt an Serum von Proben geronnenen Blutes unter Anwendung von Komple- mentfixierungs- und Fluoreszenzantikörpertests.

In einem nachfolgenden Test wurde neun neuen seronegativen Erwachsenen die gleiche Dosis (lO^TClDso) subkutan gegeben. Es wurden keine systemischen Symptome beobachtet, und alle neun Personen entwickelten Antikörper gegen CMV.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten Zytomegalie-Virus-Impfstoffes durch Passagieren von Zytomegalie-Viren (CMV) auf menschlichen diploiden Lungenfibroblasten, gekennzeichnet durch