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Die Erfindung betrifft die Verwendung von Escherichia coli, im folgenden
E. coli, Stamm DSM 6601 als Antiphlogistikum zur Behandlung von
entzündlichen Hauterkrankungen und Erkrankungen des rheumatischen
Formenkreises.
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Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 wird seit längerem in lebender
Form als probiotisches Arzneimittel zur Behandlung bestimmter
Darmerkrankungen, so bei Darmfunktionsstörungen, wie der chronischen
Obstipation und dem Reizdarmsyndrom, aber auch bei chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Morbus Crohn),
therapeutisch eingesetzt. Seine therapeutische Wirksamkeit bei diesen
Indikationen ist in einer Reihe von klinischen Studien und
Erfahrungsberichten dokumentiert (z. B. Schütz, 1989; Möllenbrink &
Bruckschen, 1994, Malchow, 1997; Kruis et al. 1997; Rembacken et al.,
1999). Alphabetisch geordnete Literaturliste ist als Anlage A beigefügt.
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Die zuvor genannten Darmerkrankungen und -dysfunktionen gehen
bekanntermaßen mit Störungen der physiologischen Darmflora einher
(Balsari et al., 1982; McKay, 1999; Onderdonk 2000; Sartor, 1997b, 2000).
So wurden sowohl beim Reizdarmsyndrom (RDS) als auch bei den
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) in verschiedenen
Untersuchungen Veränderungen der Bakterienflora des
Gastrointestinaltraktes festgestellt, wie beispielsweise Veränderungen des
normalen Darmkeimspektrums und ein erhöhter Nachweis
darmpathogener Erreger (Gorbach et al., 1968; Van der Wiel-Korstanje &
Winkler, 1975; Balsari et al., 1982; Tvede & Willumsen, 1982; Ruseler von
Embden & Both-Patoir, 1983; Bradley et al., 1987; Hartley et al., 1992;
Weber et al., 1992; Fabia et al., 1993; Kallinowski et al., 1998).
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E. coli DSM 6601 weist aufgrund seiner Fähigkeit, ein antibakteriell
wirksames Microcin zu produzieren in vitro in Co-
Kultivierungsexperimenten eine ausgeprägte Hemmwirkung, also einen
Antagonismus gegen enteropathogene Keime auf. Da dieser E. coli
Stamm auch in vivo das Wachstum darmpathogener Erreger unterdrückt
und dadurch diese unerwünschten Keime aus dem Lumen des
Gastrointestinaltraktes verdrängen kann, nahm man bisher an, daß die
therapeutische Wirksamkeit von E. coli DSM 6601 bei RDS und CED auf
seinen antimikrobiellen Wirkungen beruht.
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Es wurde jetzt festgestellt, daß E. coli DSM 6601 nicht nur die Mikroflora
im Darmlumen beeinflussen kann, sondern auch in der Lage ist, mit den
Epithelzellen des Darmes direkt zu kommunizieren. Überraschenderweise
hemmt der Zusatz von E. coli DSM 6601 zu einer Darmepithelzellkultur
(HCT15-Zellen) dosisabhängig die durch Behandlung mit Tumor-Nekrose-
Faktor (TNFα) provozierte Ausschüttung des pro-inflammatorischen
Botenstoffs Interleukin-8 (IL-8) Abb. 1. Die Sekretion von IL-8 ist eine
charakteristische Antwort der Epithelzelle auf Infektionen mit
entheropathogenen Erregern bzw. auf entzündliche Reize, wie sie als
Folge einer Infektion auftreten und dient dazu, die Abwehrzellen des
Immunsystems zu alarmieren, zu mobilisieren und an den Ort der Infektion
zu locken (Schulte et al., 1996; McCormick et al., 1998). Hier angelangt,
können die Immunzellen (Makrophagen, Granulozyten) dann die lokale
Infektion bekämpfen. Dabei kommt es unvermeidlicherweise auch stets zu
Gewebsläsionen durch die aggressiven lytischen Enzyme, die die
Immunzellen sezernieren.
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Bei ansonsten gesunden Personen bleibt nach einer Darminfektion diese
Entzündung auf den Ort der Infektion begrenzt und ist auch zeitlich
limitiert. Bei den CED dagegen breitet sich der Entzündungsprozeß immer
weiter aus und chronifiziert, da das Abwehrsystem seine natürliche
immunologische Toleranz gegenüber der eigenen Darmflora verloren hat
und diese daher als "fremd" erkennt, die normalen Darmkeime somit wie
Infektionserreger behandelt und kontinuierlich bekämpft (Macpherson et
al., 1996, Duchmann et al., 1995, 1996; Sartor, 2000). Dies führt in der
Folge bei den betroffenen Patienten zu den bekannten ausgedehnten
Gewebsschädigungen der Darmwand.
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Da der E. coli Stamm DSM 6601 die Ausschüttung des pro-
inflammatorischen Botenstoffs IL-8 aus den Darmepithelzellen
unterbinden kann, spiegelt diese Fähigkeit nicht nur einen weiteren
Wirkmechanismus des Stammes wieder, sondern ist auch geeignet, neue
Anwendungsgebiete für diesen Lebendkeimwirkstoff zu erschließen.
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Ein neues Anwendungsgebiet für den Einsatz von E. coli DSM 6601 als
probiotisches Arzneimittel ist aufgrund der neuen Erkenntnisse zur anti-
inflammatorischen Wirkung dieses Bakterienstammes die Prophylaxe von
entzündlichen intestinalen Erkrankungen. Im Bereich
gastroenterologischer Indikationen sind hier zu nennen zum einen die
prophylaktische Behandlung von Personen mit familiärer Neigung zu
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Jayanthi et al., 1991; Ma et
al., 1999; Sandler & Eisen, 2000), zum anderen die prophylaktische
Behandlung von Patienten, die Arzneimittel einnehmen müssen, welche
als Nebenwirkung Darmentzündungen auslösen können (Bjarnason &
Peters, 1996).
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Beispielhaft sie hier die Arzneimittelgruppe der nicht-steroidalen
Antirheumatika (NSAR) genannt.
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Vor allem aber bietet die überraschende Wirksamkeit von E. coli Stamm
DSM 6601 als Hemmer der IL-8-Sekretion in Epithelzellen die Möglichkeit,
diesen Keim auch bei der Behandlung von extraintestinalen Erkrankungen
entzündlicher Genese einzusetzen.
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Als extraintestinale Erkrankungen, für die eine prophylaktische oder auch
therapeutische Behandlung mit E. coli DSM 6001 möglich ist, seien hier
die atopischen und chronisch entzündlichen Hauterkrankungen wie
Neurodermitis, Psoriasis, Urtikaria und seborrhoisches Ekzem, angeführt.
Interessanterweise liegt bei Atopikern neben den bekannten
immunologischen Störungen auch eine reduzierte Permeabilitätsbarriere
im Darmtrakt vor (Benard et al., 1996; Majamaa & Isolauri, 1996), so daß
die ohnehin dysregulierte Immunabwehr dieser Patienten zusätzlich mit
einer erhöhten Translokation mikrobieller Bestandteile aus dem
Darmlumen belastet wird.
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Auch bei bestimmten entzündlichen Erkrankungen des rheumatischen
Formenkreises mit engen Beziehungen zum Gastrointestinaltrakt (z. B.
enterogene Arthritis, post-infektiöse/reaktive Arthritis, rheumatoide
Arthritis) ist der Einsatz dieses probiotischen E. coli Stammes mit anti-
inflammatorischer Wirkung, therapeutisch oder prophylaktisch angewandt,
sinnvoll.
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Epidemiologische Studien und genetische Untersuchungen haben gezeigt,
daß die o. g. entzündlichen intestinalen und extraintestinalen
Erkrankungen familiär gehäuft vorkommen, d. h. einen bestimmten
genetischen Hintergrund besitzen (CED: Jayanthi et al., 1991; Gregory &
Ho, 1992; Ma et al., 1999; Sandler & Eisen, 2000; Chronisch entzündliche
Hauterkrankungen: Barger, 1991; Bos et al., 1994; Stern, 1997; Rudikoff &
Lebwohl, 1998; Arthritiden: Benjamn & Parham, 1992; Hughes & Keat,
1994; Lahesmaa et al.; 1995; Fomberstein et al., 1996; Woo &
Wedderblum, 1998).
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Allerdings ist die erbliche Veranlagung allein bei den genannten
entzündlichen Erkrankungen im allgemeinen nicht ausreichend, um die
latent vorhandene Erkrankung zum Ausbruch zu bringen. Umweltfaktoren,
wie Infektionskeime, bestimmte Komponenten der Darmflora,
Nahrungsbestandteile oder allergene Stoffe müssen als sogenannte
Trigger-Faktoren auftreten, um die Erkrankung manifest werden zu lassen
(CED: Koutroubakis et al., 1996; Sartor, 1997a, b; Sandler & Eisen, 2000;
Chronisch entzündliche Hauterkrankungen: James & Warm, 1971;
Atherton, 1988; Boehnke, 1996; Arthritiden: Bremell et al., 1991; Nissilä et
al., 1994; Probst et al., 1994; Hazenberg, 1995).
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Aufgrund dieser Erkenntnisse ist es angebracht, solche familiär
vorbelasteten gefährdeten Personen prophylaktisch zu behandeln, um
einen möglichen Ausbruch der entzündlichen Erkrankungen zu vermeiden.
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Im Falle der Verhinderung von Arzneimittelschäden an der Darmwand ist
die direkte anti-entzündliche Wirkung von E. coli DSM 6601 auf die
Darmepithelzellen ebenfalls von grundlegender Bedeutung. Durch eine
Vorbehandlung oder Parallelbehandlung der Patienten, die beispielsweise
nicht-steroidale Antirheumatika einnehmen müssen, mit E. coli DSM 6601
kann ein Schutz des Darmepithels vor überschießenden entzündlichen
Reaktionen auf den Arzneimittelreiz erzielt werden.
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Die anti-inflammatorische Wirkung von E. coli DSM 6601 wird nachfolgend
anhand der Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Hemmung der TNFα-induzierten IL-8-Sektretion in HCT15-Epithelzellen
durch E. coli DSM 6601
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Als Zellinie wurde die humane Kolonkarzinomzellinie HCT15 verwendet,
die in DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium) mit 10% foetalem
Kälberserum (FKS) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert wurde. Untersucht
wurde die Wirkung von E. coli DSM 6601 und E. coli K-12 (als
Kontrollstamm) auf die IL-8-Sekretion der Epithelzellen nach Stimulierung
durch Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα). Dazu wurden die HCT15-Zellen in
Gewebekulturplatten mit jeweils 6 Kavitäten eingesät mit einer
Konzentration von ca. 1 × 106 Zellen pro Kavität und über Nacht bei 37°C
und 5% CO2 gezüchtet, um Adhäsion zu ermöglichen. Bakterien des
Stammes E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K-12 wurden in LB (Luria-Bertani)-
Medium in einem Gesamtvolumen von 25 ml logarithmisch wachsen
gelassen bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,6, gemessen bei einer
Wellenlänge von 600 nm. Die Bakterien wurden zweimal gewaschen und
wieder in DMEM resuspendiert. Die gewünschte Bakterienkonzentration
wurde eingestellt durch Messung der OD bei 600 nm. Die optische
Dichtemessung wurde überprüft durch Ausplattieren serieller
Verdünnungen der Bakteriensuspensionen auf LB-Agar und Bestimmung
der koloniebildenden Einheiten (KBE) nach Übernacht-Inkubation bei
37°C. HCT15-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der
Bakterien bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Danach erfolgte die
Stimulierung durch TNFα (Endkonzentration 20 ng/ml) bei 37°C für 30 bis
40 Minuten. Nach der Stimulierung durch TNFα wurden die Zellen unter
Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und zweimal mit PBS
gewaschen. Die Zellsedimente wurden suspendiert in 1 ml TRIZOL und
bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Gesamt-RNA der
Zellen wurde mit Hilfe der Trizol-Methode (Gibco BRL) extrahiert. Für die
RT-PCR wurde die "first-strand" komplementäre DNA synthetisiert unter
Verwendung von Oligo(dT) entsprechend den Angaben des Herstellers
(SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR kit,I Incitrogen). 1 µl
der 1-st-strand cDNA wurde über 25 PCR-Zyklen amplifiziert in einer
Reaktionsmischung aus 5 µl 10 × PCR-Puffer, je 2 µl von 2,5 µM Sense-
und Antisene-Primern für hIL-8 oder je 2 µl von 5,0 µM Sense- und
Antisense-Primern für hGAPDH, 4 µl dNTPs, 35,5 µl H2O und 0,5 µl Taq
Polymerase. Die PCR-Bedingungen waren: 94°C für 30 Sekunden, 55°C
für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden. Die anfängliche Denaturierungs-
und abschließenden Extensionsbedingungen waren 94°C für 5 Minuten
bzw. 72°C für 7 Minuten. Die Amplifikate wurden auf einem 2%-igen
Agarose-Gel in TBE elektrophoretisiert, und die Gele wurden mit
Ethidiumbromid gefärbt. Das Verhältnis der Bandenintensität der
Amplifikate von hIL-8 zu hGAPHD wurde bestimmt. Die folgenden PCR-
Primer-Sequenzen wurden verwendet: IL-8, 5' ctg gcc gtg gct ctc ttg gca
gcc ttc ctg und 3' ggc aac cct aca aca gac cca cac aat aca; GAPDH, 5' tga
agg tcg gag tca acg gat ttg gt und 3' cat gtg ggc cat gag cac cac.
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Die dosisabhängige Hemmung der TNFα-induzierten IL-8-Sekretion in
HCT15-Epithelzellen durch E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K-12 im
Vergleich zu reinem Kulturmedium (als Kontrolle) ist in der Abb. 1
dargestellt.
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Aus der Abbildung ergibt sich die Hemmung der TNFα-induzierten IL-8-
Sekretion in HCT15-Epithelzellen durch E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K-
12. Die Bakteriensuspensionen wurden auf 106, 107, 108 und 109 KBE/ml
eingestellt und mit den HCT15-Epithelzellen inkubiert. Aufgetragen ist die
TNFα-induzierte relative epitheliale Sekretion vin IL-8 nach Inkubation mit
den verschiedenen Bakterienkonzentrationen im Vergleich zur Kontrolle
(Kulturmedium = 100%). E. coli DSM 6601 zeigt eine deutlich effektivere
Hemmung der IL-8-Sekretion als E. coli K-12.
Beispiel 2
Behandlung von Patienten mit atopischer Dermatitis
mit E. coli DSM 6601
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58 Patienten (38 weiblich und 20 männlich im Alter zwischen 10 und 34
Jahren), die an einer klinisch gesicherten Neurodermitis (Neurodermitis
constitutionalis atopica) litten, wurden in einer Hautarztpraxis über 4
Wochen beobachtet.
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28 Patienten wendeten übliche dermatologische Präparationen an. 30
Patienten erhielten zusätzlich ein zugelassenes Präparat mit lebensfähigen E.
coli DSM 6601. Kein Patient nahm während dieser Zeit Steroide, andere
Antiphlogistika oder Antibiotika ein.
Anamnestische Befunde
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Trotz Einhaltung einer gemäßigten hypoallergenen Diät litten 31 von ihnen
unter schwerer atopischer Dermatitis mit einem für dieses Krankheitsbild im
Akutstadium typischen Lokalbefund im Gesicht, an den Extremitäten und am
Körperstamm. Bei allen wurde eine Superinfektion der Haut mit
Staphylococcus aureus nachgewiesen. 13 dieser Patienten hatten zusätzlich
einen mukokutanen Befall mit Candida sp., Streptococcus pyogenes und
Enterokokken. 7 weitere Patienten waren zusätzlich mit Corynebakterien
besiedelt. Bei 1 Patienten konnte zudem eine Infektion mit Herpes simplex
festgestellt werden.
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27 Patienten hatten eine leichtere Form der Neurodermitis mit Erythemen,
Xerosis, Lichenifikation und oberflächlichen Beugenexkoriationen. Auch bei
ihnen wurde ein Hautbefall mit Staphylococcus aureus festgestellt. 9 von
ihnen zeigten außerdem einen kutanen Befall mit Enterokokken. Zusätzlich
wurden bei 2 Patienten Corynebakterien und bei einem Patient
Enterobacteriaceaen nachgewiesen.
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Bei allen Patienten wurden neben den üblichen Sicherheitsparametern im
Blut Serumproteine mit handelsüblichen Kits (Boehringer Mannheim) und
IgE-Antikörper gegen mikrobielle Antigene (z. B. Staphylococcus aureus,
Candida albicans) mit standardisierten Enzym-Immunoassays (Padezym
PRIST und RAST, Pharmacia) gemessen.
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13 Patienten (22,4%) hatten bei offensichtlich normaler Leberfunktion und
fehlender Proteinurie eine Albuminkonzentration von weniger als 4 g/dl. 28
Patienten (48,3%) zeigten erniedrigte Gammaglobulinwerte (0,31-0,89 g/dl)
und dabei meist auch erniedrigte Gesamtserumproteine. Erhöhte Gesamt-IgE-
Werte, verbunden mit einer Eosinophilie wurden bei allen Patienten
beobachtet.
Therapie
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Alle Patienten wurden aufgefordert, die gemäßigte hypoallergene Mischkost
für die 4wöchige Behandlungszeit beizubehalten. Jeweils 15 Patienten mit
einer schweren und 15 Patienten mit einer leichten Form der Neurodermitis
erhielten über 4 Wochen zusätzlich eine Präparation mit E. coli DSM 6601.
Jeweils morgens zum Frühstück wurden 200 mg Trockenmasse (100 mg
Trockenmasse enthielten 109-1010 lebensfähige E. coli DSM 6601) mit etwas
Flüssigkeit eingenommen. Nach 4 Wochen wurde der Gesundheitszustand
aller Patienten inklusive mikrobiologischer Hautbefunde und
Serumparameter beurteilt.
Ergebnis (s. Tab. 1)
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Bei 7 (46,7%) von 15 Patienten mit schwerer Neurodermitis, die mit E. coli
DSM 6601 behandelt wurden, fanden sich nur noch leichte Symptome
(Erytheme, Lichenifikation, oberflächliche Exkorationen). 4 Patienten (26,7%)
waren beschwerdefrei. 4 weitere Patienten (26,7%) zeigten ein
unverändertes Beschwerdebild.
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Im Gegensatz dazu hatten 10 (62,5%) der unbehandelten Patienten mit
diesem Krankheitsschweregrad keine Verbesserung der Symptome, während
6 Patienten (37,5%) nur noch leichte Beschwerden hatten. Kein Patient war
beschwerdefrei. 10 der 15 Patienten (66,7%) mit der anfangs diagnostizierten
leichteren Form der Neurodermitis, die E. coli DSM 6601 erhielten, fühlten
sich beschwerdefrei und hatten nur noch verschwindend geringe
Erythematisierungen und Lichenifikationen der Haut. Bei 3 Patienten (20%)
verbesserten sich die Hautsymptome. 2 Patienten (13,3%) zeigten keine
therapeutischen Erfolge. Von den 12 unbehandelten Patienten dieses
Schweregrades zeigten 3 (25%) eine Verschlimmerung mit großflächigen
Exanthemen an Extremitäten und am Stamm, 4 (33,3%) eine Verbesserung
des Krankheitsbildes. Bei 5 (41,7%) wurden keine Veränderungen
festgestellt.
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Die mikrobiologischen Befunde zeigten eine Verminderung der
Keimbelastung der Haut in der Behandlungsgruppe, unabhängig vom
Ausgangsschweregrad. Das Keimspektrum blieb nahezu unverändert. In der
unbehandelten Gruppe wurden weder quantitativ noch qualitativ
Veränderungen gefunden. Veränderungen im Plasma-Eiweißspiegel und in
den IgE-Werten spiegelten Veränderungen im Krankheitsbild unabhängig
vom Therapieschema wider. So verminderten sich bei allen Patienten, deren
Krankheitsbild sich besserte, die erhöhten IgE-Werte; allerdings blieben die
positiven RAST-Werte erhalten. Die vorher gefundene Hypoproteinämie
verbesserte sich bei diesen Patienten und erreichte teilweise Normalwerte,
gemessen am Albumin- und Gammaglobulin-Gehalt.
Fazit
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Teile der kutanen Hautflora wie Staphylococcus aureus fungieren als
permanente Stimuli allergischer Hautreaktionen bei genetisch vorgeprägten
Personen und können Exazerbationen einer atopischen Dermatitis triggern.
In vitro führt die Stimulation von T-Zellen mit Su-perantigenen dieser
Bakterien zur Freisetzung von Zytokinen vom TH2-Muster. Über diesen Weg
können Mastzellen und Basophile zur Mediatoren-Ausschüttung induziert
werden (Wehner J. et al. Staphylococcus aureus enterotoxins induce
histamine and leukotriene release in patients with atopic eczema. Brit. J.
Dermatol. 145 (2001) 302-305). Offensichtlich wird durch die orale
Verabfolgung des E.-coli-Stammes DSM 6601 eine systemische Hemmung
inflammatorischer Zytokine erzielt. Das zeigt sich im Abklingen der
entzündlichen Hauterscheinungen beim atopischen Neurodermitiker, ohne
daß die bakterielle Hautbesiedlung maßgeblich beeinflußt wird.