DE10102687A1 - Trisomie 13-Diagnostik-Kit - Google Patents

Trisomie 13-Diagnostik-Kit

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13 eines menschlichen Fötus aus einer mütterlichen Blutprobe oder aus Amnionflüssigkeit mit mindestens zwei Paaren Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge mindestens zweier gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, die Teil von STR-DNS-Bereichen des menschlichen Chromosoms 13 sind.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Diag­ nostik-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13 eines menschlichen Fötus sowie auf einen Mikroarray hierfür und ein Verfahren zur Erfassung einer Trisomie 13. Derartige Verfahren, Diagnostik-Kits und Mikroarrays werden in der Prenatal-Diagnostik benötigt.
Normalerweise wird die genetische Information von Ge­ neration zu Generation unverändert weitergegeben, wo­ bei über den Mechanismus der "Meiose" der Genbestand­ teil in jedem Elternteil neu kombiniert und tradiert wird. Es können jedoch durch bestimmte Eigenschaften der Gene und durch mutagene Faktoren Veränderun­ gen/Mutationen am genetischen Material auftreten, die nach Art, Entstehungsweise und Ebene des Geschehens unterschiedlich klassifiziert werden. Bei sog. Chro­ mosomenmutationen bzw. -aberrationen treten Struktur­ veränderungen der Chromosomen auf. Diese Aberrationen werden meist durch Fehler in der "Meiose" verursacht und können numerischen oder strukturellen Charakter haben. Im Fall einer numerischen Aberration weicht dabei entweder die Anzahl eines einzelnen Chromosoms (Trisomie, Monosomie) oder die eines ganzen Chromoso­ mensatzes (Polyploidie) von der Norm ab. Eine der am häufigsten auftretenden Trisomien ist Trisomie 13, da im Fall von Trisomie 13 Lebendgeburten betroffener Feten beobachtet werden.
Die Trisomie 13 tritt mit einer Durchschnittshäufig­ keit von 1 : 5000 Lebendgeborenen auf. Die meisten be­ troffenen Kinder sterben im 1. Lebensjahr, nur 10% werden älter. Die mittlere Lebensdauer beträgt nur wenige Monate. Hauptmerkmale der Trisomie 13 sind Mi­ kro- oder Anophthalmie, Hypotelorismus, ein- bzw. doppelseitige Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte, Holopros­ enzephalie, Kopfhautdefekte, tiefsitzende und dyspla­ stische Ohren, postaxiale Polydaktylie, Herzfehler und Fehlbildungen des Urogenitalsystems.
Die zur Zeit verwendeten Methoden einer pränatalen Trisomie 13-Diagnostik basieren nahezu ausschließlich auf invasiven Prozeduren, wie z. B. die Amniozentese oder die Chorionzottenbiopsie, und sind demzufolge mit einem hohen Gesundheitsrisiko für Mutter und das heranwachsende Kind verbunden. Zudem sind die zur Zeit verfügbaren Analyse- bzw. Detektionsverfahren für Trisomie 13 wie z. B. cytogenetische Analysen oder die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung sehr kostenin­ tensiv und zeitaufwendig, so daß sie nicht routinemä­ ßig bei allen Schwangeren sondern lediglich bei Vor­ liegen von entsprechenden medizinischen Indikationen durchgeführt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es also, Verfahren, ein Diagnose-Kit und einen Mikroarray zur Verfügung zu stellen, mit denen ohne große Risiken für Fötus oder Mutter eine Trisomie 13 des Fötus auf einfache Art und Weise erfaßt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit gemäß An­ spruch 1, den Mikroarray gemäß Anspruch 19 sowie das Verfahren gemäß Anspruch 23 gelöst. Vorteilhafte Wei­ terbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, des erfindungsgemäßen Mikroarrays und des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Die Detektion von Trisomie 13 gemäß der vorliegenden Erfindung basiert auf einer quantitativen PCR-Methode und beinhaltet die Amplifikation von auf Chromosom 13 lokalisierten sogenannten "short tandern repeats" (STR's) bzw. "Mini-Satelliten-DNS's". Dabei handelt es sich um hypervariable, kurze DNS-Sequenzmotive (2-4 bp) in Form sogenannter Tandern-Repetitionen, d. h. hintereinander liegender Einheiten mit einer Gesamt­ länge von 100-1000 bp. Die Verwendung von automati­ sierbaren Fluoreszenz-basierenden Analysemethoden er­ laubt eine kostengünstige und zeitlich sehr kurze Probenverarbeitung, so daß das erfindungsgemäße Ver­ fahren routinemäßig allen Schwangeren zugänglich ge­ macht werden kann. In Verbindung mit einer ebenfalls erfindungsgemäßen Methodik zur nicht-invasiven Gewin­ nung von fötalen, kernhaltigen Zellen entfallen zudem sämtliche Gesundheitsrisiken für Mutter und das her­ anwachsende Kind.
Das erfindungsgemäße nicht-invasive Trisomie 13- Diagnoseverfahrens weist zwei wichtige Aspekte auf. Zum einen wird für die Trisomie 13-Detektion ein quantitatives Multiplex-PCR-Verfahren verwendet, das vorteilhafterweise drei verschiedene STR-DNA-Bereiche des Chromosoms 13 spezifisch amplifiziert. Vorteil­ hafterweise eignen sich hierzu die drei STR-Bereiche D13S631, D13S258 und D13S303. Derartige STR-DNA- Regionen sind äußerst heterogen, so daß ein diploides Individuum meist zwei verschiedene Allele eines STR's trägt, was zur Erzeugung zweier PCR-Fragmente unter­ schiedlicher Länge jedoch gleicher Quantität führt. Im Falle eines triploiden Individuums führen die drei Kopien des Chromosoms 13 entweder zur Erzeugung von drei PCR-Fragmenten unterschiedlicher Länge (die 3 Allele sind vollständig heterogen bzw. heterozygot), oder es werden nur zwei verschiedene PCR-Amplifikate erzeugt, die jedoch in einem Mengenverhältnis von 2 : 1 bzw. 1 : 2 vorliegen (2 von 3 Allelen sind homogen bzw. homozygot). In seltenen Fällen kommt es zu einer so­ genannten "equivokalen" Fragmenterzeugung, d. h. die Amplifikation eines bestimmten STR-DNA-Bereiches führt zur Erzeugung eines singulären Fragments. In diesem Fall ist es nicht möglich eine Aussage über Diploidie/Triploidie zu treffen, da sowohl zwei als auch drei Kopien des Chromosoms 13 vorliegen könnten, die Allele gleicher Größe tragen. Um dieses "Diagno­ seloch" auszuschließen, wird vorteilhafterweise ein Multiplex-PCR-Verfahren vorgeschlagen, bei dem gleichzeitig drei STR-DNA-Bereiche des Chromosoms 13 analysiert werden.
Der zweite Aspekt betrifft die Anreicherung/Isolie­ rung fötaler Zellen aus peripherem, mütterlichem Blut oder aus Amnionflüssigkeit. Vorteilhafterweise er­ folgt dabei eine Anreicherung fötaler, kern- bzw. DNA-haltige Erythrozyten aus einer mütterlichen Blut­ probe, da diese bereits in frühen Schwangerschafts­ stadien reproduzierbar und in relativ hohen Mengen im mütterlichen Blut zirkulieren.
Vorteilhafterweise kann die Anreicherung fötaler Zel­ len aus einer maternalen Blutprobe (Vollblut, Blut­ plasma, Blutserum) oder aus Amnionfluid der Schwange­ ren, wie beispielsweise fötaler Erythrozyten aus pe­ ripherem, mütterlichem Blut, durch eine Percoll- Dichtegradienten-Zentrifugation oder auch durch eine FACS-Durchflußzytometrie erfolgen.
Im folgenden werden einige Beispiele für das erfin­ dungsgemäße Kit und das erfindungsgemäße Verfahren gegeben.
Fig. 1A zeigt dabei die Ergebnisse aus Kontrollblut von gesunden Probanden;
Fig. 1B die Ergebnisse aus Kontrollblut von Triso­ mie 13-Patienten;
Fig. 1C die Ergebnisse aus reinem Wasser als Kon­ trolle.
Fig. 2A die Ergebnisse aus Anmionfluid bei einem gesunden Fötus;
Fig. 2B die Ergebnisse aus Anmionfluid bei einem Fötus mit Trisomie 13 und
Im folgenden werden zwei Beispiele für die Anreiche­ rung fötaler Erythrozyten aus peripherem mütterlichem Blut gegeben.
In einem ersten Beispiel erfolgt die Anreicherung durch eine Percoll™-Dichtegradienten-Zentrifugation. Bei einer konstanten Zentrifugalkraft und Mediumvis­ kosität ist die Sedimentationsrate von Partikeln proportional zur Partikelgröße. Diese Gesetzmäßigkeit nutzt das Verfahren der Dichtegradienten-Zentrifu­ gation, wobei in diesem Beispiel Percoll™ als Zen­ trifugationsmedium verwendet wird. Bei Percoll™ han­ delt es sich um ein Silika-Derivat, das standardmäßig zur Anreicherung/Trennung von subzellulären Partikeln verwendet wird.
Zunächst wird ein kontinuierlicher Percoll-Gradient erzeugt, der einen Dichtebereich von 1,02-1,13 g/ml abdeckt. Dafür werden 14 ml einer Percoll™-NaCl- Lösung (0,15 M NaCl), die eine Dichte von 1,07 g/ml aufweist, 30 min bei 20000 g in einem Festwinkelrotor Typ F 0630 (Beckman Coulter) zentrifugiert. Anschlie­ ßend wird der so erzeugte kontinuierliche Gradient mit 5 ml EDTA-Vollblut, d. h. in EDTA-Puffer bei­ spielsweise in standardisierten, kommerziell verfüg­ baren EDTA-Röhrchen, aufgenommenes Vollblut, über­ schichtet und 15 min bei 1000 g zentrifugiert. Nach diesem Zentrifugationsschritt verbleiben u. a. die Thrombozyten in der Serumschicht oberhalb des Gra­ dienten und werden mit einer Pasteurpipette entfernt. Ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 1000 g für 15 min führt schließlich zur Trennung der verbliebenen, unterschiedlichen Blutzelltypen entsprechend ihrer jeweiligen isopycnischen Dichten. Die Sedimentations­ schicht mit mononuklearen Blutzellen wird anschlie­ ßend mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert. Phosphat- Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) enthält in wäßriger Lö­ sung KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8,0 g/l und Na2HPO4 1,15 g/l und wird beispielsweise von Life Technologies (Cat.-No.: 14190-094) vertrieben. Die DNS der mononuklearen Blutzellen wird dann durch die Standardprozeduren des "QIAamp Blood Kit" (Qiagen, Hilden) isoliert und kann für eine Multiplex-PCR ein­ gesetzt werden.
In einem zweiten Beispiel wurden die fötalen, kern­ haltigen Erythrozyten mittels FACS-Durchflußzyto­ metrie (FACS = fluoreszenzassoziierte Zellsortierung) isoliert. Es erfolgt zunächst eine Anreicherung aller mono-nuklearer Blutzellen mittels Percoll-Dichte­ gradienten-Zentrifugtation (siehe oben). Die Sedimen­ tationsschicht mit mononuklearen Blutzellen wird da­ bei mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.
Im Anschluß an die Dichtegradienten-Zentrifugation werden 800 µl der erhaltenen Blutzellsuspension für 60 min bei 4°C mit einem Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD PharMingen (Cat.No.: 32595A) Klon: GA-R2 (HIR2) Isotype: Mouse IgG2b, K gegen das GlycophorinA-Oberflächenprotein und einem Fluorescein-Isothiocyanat (T9-FITC)-kon­ jugierten monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD PharMingen (Cat.-No.: 30984X) Klon: CB38 (NL07) Iso­ type: Mouse IgM, κ gegen den Transferrin-Rezeptor (CD36) inkubiert bzw. markiert. Ein dritter Fluores­ zenzkanal wird benutzt für die negative Diskriminie­ rung von T-, B- und NK-Zellen. Die Endkonzentration beider Antikörper beträgt jeweils 0,2 µg pro 107 Zel­ len. Die markierten Zellen werden zweimal mit PBS ge­ waschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert.
Für die Isolierung kernhaltiger Erythrozyten wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton-Dickinson) verwendet. Das System ist mit einem wassergekühlten Doppelwellenlängen-Argon-Laser (Emmissionswellenlängen 488 nm und 365 nm - UV) und einem luftgekühlten Helium-Neon-(HeNe) Laser konfiguriert und mitfluo­ reszierenden Beads (Becton Dickinson) kalibriert. Das CellQuest Programm, Hersteller: Becton Dickinson, Version: 3.3 (Cat.-No.: 342182) wird verwendet für die Datenaufnahme, Instrumentkontrolle, sowie die statistische Auswertung. Die Sortierung der Blutzel­ len erfolgt mit Zellraten von 20000-25000 Zellen pro Sekunde, wobei die Zellgröße ("forward scatter"), und die Granularität, sowie die Oberflächenstruktur ("side scatter"), die Emission der grünen Fluoreszenz (Transferin-Rezeptor, T9-FITC), die Emission der orangen Fluoreszenz (GlycophorinA, KC16-Rd) sowie die Emission der roten Fluoreszenz für die übrigen Para­ meter, wie CD45, CD3, CD19 und CD16/56 (APC oder Cy5 markiert), als Selektionskriterien verwendet werden. Um eine zusätzliche Diskriminierung von kernhaltigen Zellen zu gewährleisten wird der Kernfarbstoff Hoechst 33342 eingesetzt. Die Anregung erfolgt gleichzeitig mit der UV-Linie des Argon-Lasers. Die sortierten Zellen werden direkt in ein 1,5 ml Reakti­ onsgefäß, das mit 1 ml PBS gefüllt ist, überführt und können bei -20°C gelagert werden.
Auch hier kann die DNS der mononuklearen Blutzellen anschließend durch die Standardprozeduren des "QIAamp Blood Kit" (Fa. Qiagen, Hilden) isoliert und für eine Multiplex PCR wie im folgenden beschrieben, einge­ setzt werden.
Mit der so isolierten DNS aus kernhaltigen fötalen Erythrozyten wird eine Multiplex-PCR durchgeführt. Als Primer wurden dabei die in Tabelle I angegebenen Sequenzen verwendet. Erfindungsgemäße Kits enthalten zumindest eines der in Tabelle I angegebenen Primer­ paare. Hier wurde ein Kit verwendet, das sämtliche in Tabelle I enthaltenen Primerpaare enthielt. Die Pri­ mer PTR13S631F bzw. PTR13S631R sind Forward (F)- und Reverse (R)-Primer zur Amplifikation des STR D13S631, die Primer PTR13S258F und PTR13S258R zur Amplifikati­ on des STR D13S258 sowie die Primer PTR13S303F und PTR13S303R zur Amplifikation des STR D13S303. In der Spalte "Markierung" ist für den jeweiligen Primer an­ gegeben, ob und mit welchen Fluoreszenzfarbstoffen er markiert ist. Weiterhin ist in der vierten Spalte von Tabelle I die Größe des amplifizierten Abschnitts in Basenpaaren angegeben. Wie zu erkennen ist, liegen die jeweils amplifizierten Abschnitte ausreichend auseinander, so daß sie eindeutig identifiziert wer­ den können.
Tabelle I
PCR-Primer
Die PCR wurde anschließend mit den in Tabelle II ge­ gebenen Parametern durchgeführt. Dabei wurde ein PCR- Mastermix verwendet, dessen Zusammensetzung in Tabel­ le III angegeben ist. Die PCR wurde dabei auf einem PCR-Blockcycler PE 9700 der Firma Applied Biosystems durchgeführt.
Tabelle II
PCR-Parameter
Tabelle III
Reaktionsansatz (Reaktionsvolumen 50 µl)
Taq-Puffer bezeichnet dabei einen Taq DNA Polymerase Storage Buffer (Taq-Buffer B), der in wäßriger Lösung enthält: Tris-HCl 20 mM (pH = 8,0 bei 25°C), KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Glycerol 50% (v/v), Tween 20 0,5% (v/v), Nonidet-P40 0,5% (v/v) und bei­ spielsweise von Promega Corp. (Cat.-No: M166B) ver­ trieben wird.
Die Ergebnisse der PCR wurden mittels ABI-Fragment­ analyse ausgewertet. Hierzu wurden die einzelnen PCR- Ansätze zunächst unverdünnt eingesetzt, wobei für die ABI-Fragmentanalyse jeweils 1 µl verwendet wurde. Als PCR-Template wurde zunächst Kontrollblut von gesunden Probanden (siehe Fig. 1A) und von Trisomie 13-Patien­ ten (siehe Fig. 1B) verwendet. Das Kontrollblut der Trisomie 13-Patienten wurde hier zur Überprüfung durch cytogenetische Standardverfahren typisiert.
Die Dokumentation dieser Fragmentanalyse ist in Fig. 1 zu erkennen. In Fig. 1A ist dabei unmittelbar zu sehen, daß die Fragmente, die mit 1 bzw. 1', 2 bzw. 2' oder 3 bzw. 3' bezeichnet sind, jeweils etwa gleich hohe Fluoreszenzsignale erzeugen. Mit 1, 1' sind dabei die Fragmente bezeichnet, die durch die Primer PTR13S631 (F und R), mit 2, 2' die Fragmente, die durch die Primer PTR13S258 (F und R) und mit 3, 3' die Fragmente, die durch die Primer PTR13S303 (F und R) amplifiziert wurden, bezeichnet.
Aus Fig. 1A ist folglich zu erkennen, daß hier ledig­ lich zwei Chromosomen 13 vorliegen, d. h. daß der Pro­ band keine Trisomie 13 aufweist.
In Fig. 1B ist zu erkennen, daß die Fragmente, die mit 1, 1' bezeichnet sind, sich in einem Größenver­ hältnis von 2 : 1 befinden. Weiterhin ist im Bereich zwischen 240 Basenpaaren und 280 Basenpaaren sowie zwischen 440 bp und 470 bp jeweils ein Trippel an Fragmenten 2, 2', 2" bzw. 3, 3', 3" zu erkennen, die in etwa gleiche Signalstärken zeigen. Sowohl die Verhältnisse des Fragmentpaares 1, 1' als auch der Fragmenttrippel 2, 2', 2" und 3, 3', 3" weisen ein­ deutig auf das Vorliegen einer Trisomie 13 bei dem hier untersuchten Patienten hin.
In Fig. 1C ist eine Kontrolle dargestellt, bei der lediglich reines Wasser gemessen wurde. Es ist zu er­ kennen, daß hier keine signifikante Amplifikation von DNS erfolgte und daher keine signifikanten Signale in den relevanten Bereichen zu erkennen sind.
Fig. 2, bei der dieselben Elemente mit demselben Be­ zugszeichen wie in Fig. 1 bezeichnet sind, zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung an Proben von Amnion­ flüssigkeit (Fig. 2A und 2B). Als Ausgangsmaterial für die Extraktion von DNS wurde in diesem Beispiel Amnionflüssigkeit verwendet, wie sie bei der Amnio­ zentese gewonnen wird. Die DNA-Isolierung erfolgte vollständig wie im obigen Beispiels mittels des "QIAamp DNA Blood Kit" der Firma Qiagen, Hilden. Die weitere Amplifikation und Auswertung dieser Probe er­ folgte exakt nach demselben Protokoll wie für die Fig. 1 beschrieben. Anschließend wurde eine ABI- Fragmentanalyse durchgeführt, deren Ergebnisse in den Fig. 2A und 2B dargestellt sind.
Wie aus Fig. 2A ersichtlich ist, sind dort die jewei­ ligen Signale 1, 1' bzw. 3, 3' der amplifizerten Fragmente etwa gleich hoch. Weiterhin ist nur ein einziges Signal 2 zu erkennen, das jedoch etwa dop­ pelt so hoch ist. Es handelt sich also folglich um einen gesunden Fötus, dessen in der Amnionflüssigkeit vorhandene Zellen bestimmt wurden.
In Fig. 2B ist zu erkennen, daß die Fragmente, die mit 1, 1' bezeichnet sind, sich in einem Größenver­ hältnis von 2 : 1 befinden. Weiterhin ist im Bereich zwischen 240 Basenpaaren und 280 Basenpaaren sowie zwischen 440 bp und 470 bp jeweils ein Trippel an Fragmenten 2, 2', 2" bzw. 3, 3', 3" zu erkennen, die in etwa gleiche Signalstärken zeigen. Sowohl die Verhältnisse des Fragmentpaares 1, 1' als auch der Fragmenttrippel 2, 2', 2" und 3, 3', 3" weisen ein­ deutig auf das Vorliegen einer Trisomie 13 bei dem hier untersuchten Patienten hin.

Claims (32)

1. Diagnose-Kit für die Erfassung einer Trisomie 13 eines menschlichen Fötus mit
mindestens zwei Paaren Oligonukleotide (Reverse­ primer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple­ mentären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt ein Short- Tandern-Repeat-Bereich (STR-DNS-Bereich) des menschlichen Chromosoms 13 ist.
2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt drei verschiedene Paare Oligonukleotide (Reverse­ primer, Forwardprimer) enthält,
wobei die beiden Oligonukleotide jedes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerase- Kettenreaktion jeweils eines der beiden komple­ mentären Stränge jeweils verschiedener Short- Tandem-Repeat-DNS-Bereiche des menschlichen Chromosoms 13 geeignet sind.
3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Short- Tandern-Repeat-Bereich der Bereich D13S631, D13S258 und/oder D13S303 ist.
4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion er­ forderlichen Substanzen enthält.
5. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion er­ forderliche Substanzen eine Pufferlösung, Mag­ nesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate, und/oder eine hitzestabile Polymerase enthält.
6. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.
7. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Po­ sitivkontrolle eine DNS-Probe mit zumindest ei­ nem der gesuchten DNS-Abschnitte enthält.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren markiert sind.
9. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide der verschiedenen Paare mit verschiedenen Fluo­ rophoren markiert sind.
10. Diagnose-Kit nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Oligonukleotide des ersten und des zweiten Paares mit verschiedenen Fluoropho­ ren markiert sind.
11. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligo­ nukleotide der Paare folgende Sequenzen aufwei­ sen:
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und TAGCCCTCACCATGATTGG und/oder
ACCTGCCAAATTTTACCAGG und GACAGAGAGAGGGAATAAACC und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC und TGTACCCATTAACCATCCCCA
12. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit folgender Sequenz
ACCTGCCAAATTTTACCAGG
mit dem Fluorophor 5'-NED markiert ist.
13. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz
GGCAACAAGAGCAAAACTCT und/oder
ACATCGCTCCTTACCCCATC
mit dem Fluorophor 4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein markiert ist.
14. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Anleitung zur Durchführung einer DNS- Isolierung und/oder
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment­ analyse enthält.
15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergeb­ nisse enthält.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Nucleinsäure-Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wo­ bei der Array eine Anzahl Zellen (Felder) auf­ weist und in mindestens einer Zelle ein Oligonu­ kleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.
17. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oli­ gonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotides, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
18. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleo­ tid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridi­ sieren.
19. Mikroarray zur Erfassung einer Trisomie 13, bei­ spielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen (Fel­ dern), dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt hybridisiert, der Teil von Short-Tandern-Repeat-Bereichen des menschlichen Chromosoms 13 ist.
20. Mikroarray nach Anspruch 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist, wo­ bei die Sequenz des Oligonukleotides, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unter­ scheidet.
21. Mikroarray nach Anspruch 19 oder 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen je­ weils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligo­ nukleotide mit verschiedenen gesuchten DNS- Abschnitten hybridisieren.
22. Mikroarray nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Short-Tandern- Repeat-Bereich der Bereich D13S631, D13S258 und/oder D13S303 ist.
23. Verfahren zur Erfassung einer Trisomie 13 eines menschlichen Fötus, dadurch gekennzeichnet, daß in einer maternalen Blutprobe oder Amnionflüs­ sigkeit mindestens zwei gesuchte DNS-Abschnitte, die Teil eines Short-Tandern-Repeat-Bereiches (STR-DNS-Bereiches) des menschlichen Chromosoms 13 sind, durch eine Polymerase-Kettenreaktion mittels mindestens zweier verschiedener Paare von Oligonukleotiden amplifiziert werden, wobei die beiden Oligonukleotide des mindestens einen Paares zur Amplifikation jeweils eines der kom­ plementären Stränge der beiden gesuchten DNS- Abschnitte geeignet sind, und zuletzt die amplifizierte DNS quantitativ nach­ gewiesen wird.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da­ durch gekennzeichnet, daß vor der Amplifikation die DNS-haltigen Bestandteile in der maternalen Blutprobe oder der Amnionflüssigkeit zuerst auf­ konzentriert werden.
25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da­ durch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der DNS-haltigen Bestandteile eine Sedimentation der maternalen Blutprobe (Blutsatz) oder der Am­ nionflüssigkeit durchgeführt wird.
26. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf­ konzentration der DNS-haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthaltener nukleierter fötaler Erythrozyten durchgeführt und anschließend die zellfrei vorliegende DNS abzentrifugiert und für die weitere Diagnose gewonnen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich­ net, daß aus der maternalen Blutprobe das Blut­ plasma/Blutserum gewonnen wird und anschließend die gesuchten DNS-Abschnitte durch eine Polyme­ rase-Kettenreaktion mittels der in dem Kit ent­ haltenen Oligonukleotide amplifiziert werden und zuletzt die amplifizierte DNS nachgewiesen wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Short-Tandern- Repeat-Bereich der Bereich D13S6311, D13S258 und/oder D13S303 verwendet wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am­ plifizierten DNS die von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden abgegebene Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 19 verwendet wird.
31. Verwendung eines Kits, eines Oligonukleotid- Mikroarray und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur pränatalen, nicht-invasiven Erfassung einer Trisomie 13 ei­ nes menschlichen Fötus.
32. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur pränatalen, nicht-invasiven Erfassung einer Tri­ somie 13 eines menschlichen Fötus aus einer ma­ ternalen Blutprobe oder Amnionflüssigkeit.
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